引用本文： 魏圆梦, 李苗, 彭海鹰, 周钟强, 唐贺, 史平玲, 梁迎娟, 田美芝. 早发性严重视网膜营养不良一家系TULP1和CNGB1基因突变. 中华眼底病杂志, 2021, 37(1): 47-53. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20200427-00182 复制
早发性严重视网膜营养不良（EOSRD）是一种严重影响视功能的遗传性视网膜疾病，目前部分学者认为其是Leber先天性黑矇（LCA）较轻的一种亚型[1-2]。大多EOSRD患者于1～5岁发病，其眼底及全视野视网膜电图（ff-ERG）表现与LCA相似，但视功能相对LCA更好[1-2]。本病为常染色体隐性遗传，偶见显性遗传。目前确定与LCA/ EOSRD相关的基因有25个，但这些基因仅能解释70%～80% LCA和（或）EOSRD患者的发病原因[1-2]。我们采用目标区域捕获测序方法对一个汉族EOSRD家系进行检测，在Tubby样蛋白（TULP）1基因、环核苷酸门控通道β1（CNGB1）基因发现3个新的变异位点。现将检测结果报道如下。
1 对象和方法
回顾性临床研究。本研究经河南省立眼科医院伦理委员会审批[批文号：HNEECKY-2019（15号）]，严格遵守《赫尔辛基宣言》原则。所有受试者及未成年受试者监护人均签署书面知情同意书。
2018年8月于河南省立眼科医院检查确诊的一个汉族EOSRD家系（图1）中1例患者及3名家系成员纳入本研究。详细询问和记录该家系家族史；患者及3名家系成员均行最佳矫正视力（BCVA）、裂隙灯显微镜联合前置镜、全景眼底彩色照相、频域光相干断层扫描（SD-OCT）及ff-ERG检查。
图1
早发性严重视网膜营养不良患者家系图。□：正常男性；○：正常女性；●：女性患者；↗：先证者
采集受试者外周静脉血5 ml，乙二胺四乙酸抗凝。按照标准提取流程，采用康为试剂生物技术有限公司的磁珠法血液基因组提取试剂盒提取4名受试者全基因组DNA；采用美国GE公司的NavoVue微型光度计对提取的DNA进行质量检测，将符合要求的基因组DNA分装后于−20 ℃保存待用。
提取得到的基因组DNA，采用北京中因科技有限公司自主开发设计的捕获芯片，应用安捷伦公司的捕获试剂盒，构建捕获片段文库。通过Illumina HiSeq高通量测序平台测序，二代Panel的平均测序深度为500X，数据量为1G。测序结果比对人类参考基因组检出并注释变异，对变异采用Sanger测序进行验证。其后根据多个数据库信息和蛋白功能预测软件结果，筛选可能的致病变异位点，变异的检出、注释和筛选的详细方法同文献[3]。所有基因序列参考美国国立生物技术信息中心（NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）和基因组数据库网站（http://asia.ensembl.org/index.html）。
通过NCBI数据库对变异基因翻译的氨基酸序列进行保守性分析。应用蛋白功能预测软件SIFT、Polyphen2、Mutation Taster（http://www.mutationtaster.org/）和PROVEAN等进行基因变异致病性预测。应用I-TASSER软件建立蛋白结构模型。参考美国遗传学和基因组学学院（ACMG）标准和指南[4]，对所有变异位点进行致病等级评估。
2 结果
先证者（Ⅱ2），女，6岁。其父母诉患儿于1岁以后开始出现双眼夜间视力差。患儿右眼BCVA +1.50/－3.25×180→0.1，左眼BCVA +1.25/－3.75×175→0.1。双眼眼前节及玻璃体未见异常。双眼视盘颜色稍淡，视网膜血管管径稍变细，血管弓外视网膜可见广泛色素改变（图2）。双眼眼球运动正常，未见明显眼球震颤。眼位检查33 cm映光外斜15°。SD-OCT检查可见双眼黄斑中心凹处外界膜、椭圆体带及嵌合体带结构欠清、断续；中心凹外可视区神经上皮外丛状层、外核层、外界膜、椭圆体带及嵌合体带逐渐消失，色素上皮层厚度欠均匀（图3）。ff-ERG检查，双眼视锥、视杆系统功能严重下降（图4）。其他家系成员均无EOSRD典型临床特征，符合常染色体隐性遗传。
图2
早发性严重视网膜营养不良家系中先证者双眼彩色眼底像。2A、2B分别示右眼、左眼。双眼视盘颜色稍淡，视网膜血管管径稍变细，血管弓外视网膜可见广泛色素改变
图3
早发性严重视网膜营养不良家系中先证者频域光相干断层扫描像。左图为扫描方向，右图为检查结果。3A、3B分别示右眼、左眼。双眼黄斑中心凹处外界膜、椭圆体带及嵌合体带结构欠清、断续；中心凹外可视区神经上皮外丛状层、外核层、外界膜、椭圆体带及嵌合体带逐渐消失，色素上皮层厚度欠均匀
图4
早发性严重视网膜营养不良家系中先证者全视野视网膜电图（ERG）像。绿色波形为右眼；蓝色波形为左眼。4A示暗适应0.01 ERG；4B示暗适应3.0 ERG；4C示暗适应10.0 ERG；4D示暗适应3.0震荡电位；4E示明适应3.0 ERG；4F示明适应3.0闪烁光ERG。双眼均未检测到明显波形
先证者检测到TULP1基因的纯合突变c.921C＞A（p.Cys307*）以及CNGB1基因的复合杂合突变c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）。先证者父亲（Ⅰ1）携带TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）和CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）；母亲（Ⅰ2）、兄长（Ⅱ1）携带TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）和CNGB1基因c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）。3名家系成员的2个基因均为复合杂合突变（图5）。
图5
早发性严重视网膜营养不良家系基因测序图。M1：Tubby样蛋白1（TULP1） c.921C＞A（p.Cys307*）；M2：环核苷酸门控通道β1（CNGB1）c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）；M3：CNGB1 c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）。Ⅱ2：先证者；Ⅰ1：先证者父亲；Ⅰ2：先证者母亲；Ⅱ1：先证者兄长。先证者父亲、母亲、兄长携带TULP1基因c.921C＞A突变；父亲携带CNGB1基因c.3121C＞T突变；母亲、兄长携带CNGB1基因c.3488G＞A突变；先证者同时携带3个突变位点
与数据库对比发现，TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）在ExAC等数据库未见收录；CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）在ExAC、GnomAD中收录的突变频率均为0.000 01，千人基因组计划数据库中未见收录；CNGB1基因c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）在ExAC、GnomAD、千人基因组计划数据库中收录的突变频率分别为0.000 09、0.000 08和0.000 1。
氨基酸保守性分析发现，TULP1基因翻译的氨基酸序列第307位半胱氨酸在人、黑猩猩、猕猴、犬、牛、小白鼠、褐鼠、鸡、爪蟾中高度保守（图6A），c.921C＞A（p.Cys307*）导致蛋白质翻译在高度保守区终止并丧失功能。CNGB1基因翻译的氨基酸序列第1041位精氨酸在人、黑猩猩、卷尾猴、宽吻海豚、牛、赤鹿、刺猬、北美鼠兔、吸血蝠中高度保守（图6B），c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）导致碱性的精氨酸突变为非极性的色氨酸。CNGB1基因翻译的氨基酸序列第1163位甘氨酸在人、大猩猩、乌干达红疣猴、豚尾猴、狮尾狒、野骆驼、东非狒狒中高度保守（图6C），c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）导致中性的甘氨酸突变为酸性的谷氨酸。此3个位点的氨基酸对蛋白质结构和功能具有重要作用。
图6
Tubby样蛋白1（TULP1）基因、环核苷酸门控通道β1（CNGB1）基因在多个物种中的保守性分析图。6A示 TULP1基因氨基酸序列第307位半胱氨酸，在人、黑猩猩、猕猴、犬、牛、小白鼠、褐鼠、鸡、爪蟾中高度保守；6B示CNGB1基因氨基酸序列第1163位甘氨酸，在人、大猩猩、乌干达红疣猴、豚尾猴、狮尾狒、野骆驼、东非狒狒中高度保守；6C示CNGB1基因氨基酸序列第1041位精氨酸，在人、黑猩猩、卷尾猴、宽吻海豚、牛、赤鹿、刺猬、北美鼠兔、吸血蝠中高度保守
生物信息学分析和致病性推断，TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）在蛋白质保守区出现翻译终止，CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）在蛋白质保守区出现氨基酸极性变化，导致蛋白质空间结构产生较大改变（图7）。3个突变位点经Mutation Taster分析预测均为致病突变。CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）SIFT分析预测值分别为0.000和0.087；Polyphen2分析预测值分别为1.000和0.784；PROVEAN分析预测值分别为−7.740和−3.080。根据ACMG标准和指南[3]评判：TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）突变为致病性突变；CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）为可能致病性突变。
图7
环核苷酸门控通道β1（CNGB1）蛋白三维分子结构分析图。7A示野生型位点；7B示突变型位点。c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）使CNGB1质序列第1041位碱性的精氨酸（p.R1041）突变为非极性的色氨酸（p.1041W），c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）使CNGB1蛋白质序列第1163位中性的甘氨酸（p.G1163）突变为酸性的谷氨酸（p.1163E），导致蛋白质空间结构产生较大改变
3 讨论
本研究在一个常染色体隐性遗传汉族EOSRD家系中发现了3个新的致病突变位点，TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）、CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）。虽然根据患者的病史、视力、眼底检查及ff-ERG表现，EOSRD诊断并不困难，但将其与LCA鉴别却不易。虽然EOSRD患者视力相对LCA较好，但由于EOSRD与LCA患者就诊时视力已经明显受损，难以通过视力、眼底及ff-ERG表现甚至基因检测结果将其严格区分。目前认为EOSRD与LCA的唯一鉴别点是发病年龄[1-2]。一般认为患者发病年龄＜1岁为LCA，1～5岁为EOSRD[1-2]。本家系中先证者诊断为EOSRD，其主要原因是其父母明确表述患者为1岁后发病。
TULP1定位于6p21.31，由15个外显子组成，编码542个氨基酸，是TULP家族中的一员[5]。TULP蛋白以高度保守的c端Tubby结构域为特征，TULP1基因中的大多数致病突变聚集在TULP1的Tubby区域[6]。TULP1是一种光感受器特异性蛋白，参与了由内节合成的若干光转导蛋白向外节的转运；其定位于容纳内质网、高尔基体和其他生物合成机制的细胞室，并被认为是作为一种伴侣蛋白或适配器蛋白，将装载货物的囊泡与运动蛋白连接起来进行运输，这些蛋白的目的地是光感受器细胞的外节室[7-9]。有研究表明，在视网膜中，TULP1主要通过光感受器细胞表达，光感受器细胞通过突触与内视网膜进行交流，TULP1在光感受器突触前末端的活性区高度富集，与主要的内吞作用蛋白一起靠近突触带，TULP1基因对于保持内吞作用蛋白在活性区富集以及在突触带附近维持高水平的内吞作用活性至关重要[10]。TULP1是目前已确定的与EOSRD发病相关的基因[1-2]，与遗传性视网膜疾病相关的TULP1突变至少有59种，包括 c.99+1G＞A和c.1204G＞T（p.Glu402X）或c.1376_1377del（p.I459RfsX12）、c.725_728del（p.P242QfsX16）复合杂合突变[11-12]，c.1381C＞G（p.Leu461Val）等杂合突变[13-14]以及c.1102G＞T（p.Gly368Trp）、c.1198C4T（p.Arg400Trp）、c.1145T＞C（p.Phe382Ser）等纯合突变[11-12,15]。本研究发现的TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）纯合突变目前尚未见报道。
CNGB1定位于16q21，由33个外显子组成，编码1251个氨基酸。CNGB1与CNGA1基因产物共同形成异四聚体杆状光感受器环核苷酸门控通道，在杆状细胞中，CNGB1位点编码通道β亚基和两个相关的富含谷氨酸的蛋白（GARP），即GARP1和GARP2[16]。有研究表明，视觉的第一步发生在光感受器的外部，光异构化的视紫红质激活G蛋白转导素，而G蛋白转导素反过来抑制杆状特异性cGMP磷酸二酯酶（PDE6），激活的PDE6迅速降低cGMP浓度，导致cGMP门控通道关闭，质膜通道和细胞超极化，光信号通过光感受器传递给视网膜并最终传递给视觉皮层[17]。在杆状光感受器细胞中，GARP2具有调节PDE6的作用[18]，同时GARP2和β-亚基上的N端GARP延伸可以与杆状外节圆盘边缘的外周蛋白-2形成复合物，有助于稳定光感受器杆状外节高度有序的结构[19]。与遗传性视网膜疾病相关的CNGB1突变至少有26种，包括c.299A＞G（p.His100Arg）杂合突变[20-21]和c.3444+1G＞A纯合突变[15]等。本研究发现的CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）复合杂合突变目前尚未见报道。
本研究家系中3名成员携带TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）杂合突变和CNGB1基因一个杂合突变c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）或c.3488G＞A（p.Gly1163Glu），但其并无临床表现；而先证者携带TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）纯合突变、CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）复合杂合突变，即出现症状。这提示该家系的遗传方式为常染色体隐性遗传。但究竟是TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）纯合突变直接致病，还是CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）复合杂合突变致病，亦或是TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）纯合突变和CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）复合杂合突变同时存在时才致病目前尚不能确定，需进一步更为深入地研究。
本研究的优势在于发现了EOSRD的3个新的突变位点，扩大了已报道基因的突变谱，对更深入了解EOSRD的发病机制提供了一定帮助。但存在以下不足：（1）仅1个家系，因此研究的外推性欠佳；（2）仅对患者及其兄长、父母进行了检测，未对其他家族成员进行研究，因此不能确认上述3个新的突变位点分别来源于整个家系的哪些家族成员。（3）仅从样本中测序发现突变基因，尚缺少围绕基因功能方面的实验验证。
早发性严重视网膜营养不良（EOSRD）是一种严重影响视功能的遗传性视网膜疾病，目前部分学者认为其是Leber先天性黑矇（LCA）较轻的一种亚型[1-2]。大多EOSRD患者于1～5岁发病，其眼底及全视野视网膜电图（ff-ERG）表现与LCA相似，但视功能相对LCA更好[1-2]。本病为常染色体隐性遗传，偶见显性遗传。目前确定与LCA/ EOSRD相关的基因有25个，但这些基因仅能解释70%～80% LCA和（或）EOSRD患者的发病原因[1-2]。我们采用目标区域捕获测序方法对一个汉族EOSRD家系进行检测，在Tubby样蛋白（TULP）1基因、环核苷酸门控通道β1（CNGB1）基因发现3个新的变异位点。现将检测结果报道如下。
1 对象和方法
回顾性临床研究。本研究经河南省立眼科医院伦理委员会审批[批文号：HNEECKY-2019（15号）]，严格遵守《赫尔辛基宣言》原则。所有受试者及未成年受试者监护人均签署书面知情同意书。
2018年8月于河南省立眼科医院检查确诊的一个汉族EOSRD家系（图1）中1例患者及3名家系成员纳入本研究。详细询问和记录该家系家族史；患者及3名家系成员均行最佳矫正视力（BCVA）、裂隙灯显微镜联合前置镜、全景眼底彩色照相、频域光相干断层扫描（SD-OCT）及ff-ERG检查。
图1
早发性严重视网膜营养不良患者家系图。□：正常男性；○：正常女性；●：女性患者；↗：先证者
采集受试者外周静脉血5 ml，乙二胺四乙酸抗凝。按照标准提取流程，采用康为试剂生物技术有限公司的磁珠法血液基因组提取试剂盒提取4名受试者全基因组DNA；采用美国GE公司的NavoVue微型光度计对提取的DNA进行质量检测，将符合要求的基因组DNA分装后于−20 ℃保存待用。
提取得到的基因组DNA，采用北京中因科技有限公司自主开发设计的捕获芯片，应用安捷伦公司的捕获试剂盒，构建捕获片段文库。通过Illumina HiSeq高通量测序平台测序，二代Panel的平均测序深度为500X，数据量为1G。测序结果比对人类参考基因组检出并注释变异，对变异采用Sanger测序进行验证。其后根据多个数据库信息和蛋白功能预测软件结果，筛选可能的致病变异位点，变异的检出、注释和筛选的详细方法同文献[3]。所有基因序列参考美国国立生物技术信息中心（NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）和基因组数据库网站（http://asia.ensembl.org/index.html）。
通过NCBI数据库对变异基因翻译的氨基酸序列进行保守性分析。应用蛋白功能预测软件SIFT、Polyphen2、Mutation Taster（http://www.mutationtaster.org/）和PROVEAN等进行基因变异致病性预测。应用I-TASSER软件建立蛋白结构模型。参考美国遗传学和基因组学学院（ACMG）标准和指南[4]，对所有变异位点进行致病等级评估。
2 结果
先证者（Ⅱ2），女，6岁。其父母诉患儿于1岁以后开始出现双眼夜间视力差。患儿右眼BCVA +1.50/－3.25×180→0.1，左眼BCVA +1.25/－3.75×175→0.1。双眼眼前节及玻璃体未见异常。双眼视盘颜色稍淡，视网膜血管管径稍变细，血管弓外视网膜可见广泛色素改变（图2）。双眼眼球运动正常，未见明显眼球震颤。眼位检查33 cm映光外斜15°。SD-OCT检查可见双眼黄斑中心凹处外界膜、椭圆体带及嵌合体带结构欠清、断续；中心凹外可视区神经上皮外丛状层、外核层、外界膜、椭圆体带及嵌合体带逐渐消失，色素上皮层厚度欠均匀（图3）。ff-ERG检查，双眼视锥、视杆系统功能严重下降（图4）。其他家系成员均无EOSRD典型临床特征，符合常染色体隐性遗传。
图2
早发性严重视网膜营养不良家系中先证者双眼彩色眼底像。2A、2B分别示右眼、左眼。双眼视盘颜色稍淡，视网膜血管管径稍变细，血管弓外视网膜可见广泛色素改变
图3
早发性严重视网膜营养不良家系中先证者频域光相干断层扫描像。左图为扫描方向，右图为检查结果。3A、3B分别示右眼、左眼。双眼黄斑中心凹处外界膜、椭圆体带及嵌合体带结构欠清、断续；中心凹外可视区神经上皮外丛状层、外核层、外界膜、椭圆体带及嵌合体带逐渐消失，色素上皮层厚度欠均匀
图4
早发性严重视网膜营养不良家系中先证者全视野视网膜电图（ERG）像。绿色波形为右眼；蓝色波形为左眼。4A示暗适应0.01 ERG；4B示暗适应3.0 ERG；4C示暗适应10.0 ERG；4D示暗适应3.0震荡电位；4E示明适应3.0 ERG；4F示明适应3.0闪烁光ERG。双眼均未检测到明显波形
先证者检测到TULP1基因的纯合突变c.921C＞A（p.Cys307*）以及CNGB1基因的复合杂合突变c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）。先证者父亲（Ⅰ1）携带TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）和CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）；母亲（Ⅰ2）、兄长（Ⅱ1）携带TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）和CNGB1基因c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）。3名家系成员的2个基因均为复合杂合突变（图5）。
图5
早发性严重视网膜营养不良家系基因测序图。M1：Tubby样蛋白1（TULP1） c.921C＞A（p.Cys307*）；M2：环核苷酸门控通道β1（CNGB1）c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）；M3：CNGB1 c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）。Ⅱ2：先证者；Ⅰ1：先证者父亲；Ⅰ2：先证者母亲；Ⅱ1：先证者兄长。先证者父亲、母亲、兄长携带TULP1基因c.921C＞A突变；父亲携带CNGB1基因c.3121C＞T突变；母亲、兄长携带CNGB1基因c.3488G＞A突变；先证者同时携带3个突变位点
与数据库对比发现，TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）在ExAC等数据库未见收录；CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）在ExAC、GnomAD中收录的突变频率均为0.000 01，千人基因组计划数据库中未见收录；CNGB1基因c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）在ExAC、GnomAD、千人基因组计划数据库中收录的突变频率分别为0.000 09、0.000 08和0.000 1。
氨基酸保守性分析发现，TULP1基因翻译的氨基酸序列第307位半胱氨酸在人、黑猩猩、猕猴、犬、牛、小白鼠、褐鼠、鸡、爪蟾中高度保守（图6A），c.921C＞A（p.Cys307*）导致蛋白质翻译在高度保守区终止并丧失功能。CNGB1基因翻译的氨基酸序列第1041位精氨酸在人、黑猩猩、卷尾猴、宽吻海豚、牛、赤鹿、刺猬、北美鼠兔、吸血蝠中高度保守（图6B），c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）导致碱性的精氨酸突变为非极性的色氨酸。CNGB1基因翻译的氨基酸序列第1163位甘氨酸在人、大猩猩、乌干达红疣猴、豚尾猴、狮尾狒、野骆驼、东非狒狒中高度保守（图6C），c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）导致中性的甘氨酸突变为酸性的谷氨酸。此3个位点的氨基酸对蛋白质结构和功能具有重要作用。
图6
Tubby样蛋白1（TULP1）基因、环核苷酸门控通道β1（CNGB1）基因在多个物种中的保守性分析图。6A示 TULP1基因氨基酸序列第307位半胱氨酸，在人、黑猩猩、猕猴、犬、牛、小白鼠、褐鼠、鸡、爪蟾中高度保守；6B示CNGB1基因氨基酸序列第1163位甘氨酸，在人、大猩猩、乌干达红疣猴、豚尾猴、狮尾狒、野骆驼、东非狒狒中高度保守；6C示CNGB1基因氨基酸序列第1041位精氨酸，在人、黑猩猩、卷尾猴、宽吻海豚、牛、赤鹿、刺猬、北美鼠兔、吸血蝠中高度保守
生物信息学分析和致病性推断，TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）在蛋白质保守区出现翻译终止，CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）在蛋白质保守区出现氨基酸极性变化，导致蛋白质空间结构产生较大改变（图7）。3个突变位点经Mutation Taster分析预测均为致病突变。CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）SIFT分析预测值分别为0.000和0.087；Polyphen2分析预测值分别为1.000和0.784；PROVEAN分析预测值分别为−7.740和−3.080。根据ACMG标准和指南[3]评判：TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）突变为致病性突变；CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）为可能致病性突变。
图7
环核苷酸门控通道β1（CNGB1）蛋白三维分子结构分析图。7A示野生型位点；7B示突变型位点。c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）使CNGB1质序列第1041位碱性的精氨酸（p.R1041）突变为非极性的色氨酸（p.1041W），c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）使CNGB1蛋白质序列第1163位中性的甘氨酸（p.G1163）突变为酸性的谷氨酸（p.1163E），导致蛋白质空间结构产生较大改变
3 讨论
本研究在一个常染色体隐性遗传汉族EOSRD家系中发现了3个新的致病突变位点，TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）、CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）。虽然根据患者的病史、视力、眼底检查及ff-ERG表现，EOSRD诊断并不困难，但将其与LCA鉴别却不易。虽然EOSRD患者视力相对LCA较好，但由于EOSRD与LCA患者就诊时视力已经明显受损，难以通过视力、眼底及ff-ERG表现甚至基因检测结果将其严格区分。目前认为EOSRD与LCA的唯一鉴别点是发病年龄[1-2]。一般认为患者发病年龄＜1岁为LCA，1～5岁为EOSRD[1-2]。本家系中先证者诊断为EOSRD，其主要原因是其父母明确表述患者为1岁后发病。
TULP1定位于6p21.31，由15个外显子组成，编码542个氨基酸，是TULP家族中的一员[5]。TULP蛋白以高度保守的c端Tubby结构域为特征，TULP1基因中的大多数致病突变聚集在TULP1的Tubby区域[6]。TULP1是一种光感受器特异性蛋白，参与了由内节合成的若干光转导蛋白向外节的转运；其定位于容纳内质网、高尔基体和其他生物合成机制的细胞室，并被认为是作为一种伴侣蛋白或适配器蛋白，将装载货物的囊泡与运动蛋白连接起来进行运输，这些蛋白的目的地是光感受器细胞的外节室[7-9]。有研究表明，在视网膜中，TULP1主要通过光感受器细胞表达，光感受器细胞通过突触与内视网膜进行交流，TULP1在光感受器突触前末端的活性区高度富集，与主要的内吞作用蛋白一起靠近突触带，TULP1基因对于保持内吞作用蛋白在活性区富集以及在突触带附近维持高水平的内吞作用活性至关重要[10]。TULP1是目前已确定的与EOSRD发病相关的基因[1-2]，与遗传性视网膜疾病相关的TULP1突变至少有59种，包括 c.99+1G＞A和c.1204G＞T（p.Glu402X）或c.1376_1377del（p.I459RfsX12）、c.725_728del（p.P242QfsX16）复合杂合突变[11-12]，c.1381C＞G（p.Leu461Val）等杂合突变[13-14]以及c.1102G＞T（p.Gly368Trp）、c.1198C4T（p.Arg400Trp）、c.1145T＞C（p.Phe382Ser）等纯合突变[11-12,15]。本研究发现的TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）纯合突变目前尚未见报道。
CNGB1定位于16q21，由33个外显子组成，编码1251个氨基酸。CNGB1与CNGA1基因产物共同形成异四聚体杆状光感受器环核苷酸门控通道，在杆状细胞中，CNGB1位点编码通道β亚基和两个相关的富含谷氨酸的蛋白（GARP），即GARP1和GARP2[16]。有研究表明，视觉的第一步发生在光感受器的外部，光异构化的视紫红质激活G蛋白转导素，而G蛋白转导素反过来抑制杆状特异性cGMP磷酸二酯酶（PDE6），激活的PDE6迅速降低cGMP浓度，导致cGMP门控通道关闭，质膜通道和细胞超极化，光信号通过光感受器传递给视网膜并最终传递给视觉皮层[17]。在杆状光感受器细胞中，GARP2具有调节PDE6的作用[18]，同时GARP2和β-亚基上的N端GARP延伸可以与杆状外节圆盘边缘的外周蛋白-2形成复合物，有助于稳定光感受器杆状外节高度有序的结构[19]。与遗传性视网膜疾病相关的CNGB1突变至少有26种，包括c.299A＞G（p.His100Arg）杂合突变[20-21]和c.3444+1G＞A纯合突变[15]等。本研究发现的CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）复合杂合突变目前尚未见报道。
本研究家系中3名成员携带TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）杂合突变和CNGB1基因一个杂合突变c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）或c.3488G＞A（p.Gly1163Glu），但其并无临床表现；而先证者携带TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）纯合突变、CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）复合杂合突变，即出现症状。这提示该家系的遗传方式为常染色体隐性遗传。但究竟是TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）纯合突变直接致病，还是CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）复合杂合突变致病，亦或是TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）纯合突变和CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）复合杂合突变同时存在时才致病目前尚不能确定，需进一步更为深入地研究。
本研究的优势在于发现了EOSRD的3个新的突变位点，扩大了已报道基因的突变谱，对更深入了解EOSRD的发病机制提供了一定帮助。但存在以下不足：（1）仅1个家系，因此研究的外推性欠佳；（2）仅对患者及其兄长、父母进行了检测，未对其他家族成员进行研究，因此不能确认上述3个新的突变位点分别来源于整个家系的哪些家族成员。（3）仅从样本中测序发现突变基因，尚缺少围绕基因功能方面的实验验证。
