引用本文： 陈飞, 沈吟. 新型光遗传学工具Channelrhodopsin-XXM2.0和PsCatCh2.0恢复视觉功能的可行性分析. 中华眼底病杂志, 2020, 36(11): 838-845. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20200529-00253 复制
遗传性视网膜疾病（IRDs）和老年性黄斑变性（AMD）会导致视网膜光感受器细胞凋亡，最终可致视力完全丧失。虽然IRDs和AMD光感受器细胞凋亡，但视网膜内核层及RGC层仍可在一定的时间窗内保持结构功能的完整并可向大脑视觉中枢传递信息。目前，至少有270个基因位点突变与IRDs相关，而且已知AMD是由多基因突变导致[1-2]。其治疗手段包括干细胞移植、基因治疗、视网膜假体植入及光遗传学等[3-7]。光遗传学正是利用退行性病变视网膜剩余结构的完整性，以腺相关病毒（AAV）为载体将光敏蛋白靶向表达在视锥细胞[8]（退行性病变早期）、ON型双极细胞或RGC（退行性病变中晚期）来恢复视网膜的光反应[9-10]。除此之外还可结合干细胞、虚拟现实系统和全息成像技术等来恢复视觉功能[11-13]。光遗传学作为一个不依赖突变位点基因功能，并能在单细胞水平响应光刺激的治疗策略，在治疗IRDs和AMD上有很大潜力[14-15]。然而，光遗传学工具的生物学性能一直是限制视觉功能恢复的关键因素，尤其是光敏感性和动力学。目前，应用于视觉功能恢复的光遗传学工具包括微生物和哺乳动物光敏蛋白两大类，但均因其各自的不足受到限制。随着基因工程技术的进步，改造微生物光敏蛋白的特性，提高光敏感性变得可行。为此，本研究初步探讨了新型光遗传学工具Channelrhodopsin-XXM2.0和Channelrhodopsin-PsCatCh2.0的光敏感性及动力学特征，分析两者是否可用于光遗传学视觉功能的恢复。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要实验材料
HEK 293T细胞系、质粒pCIG（c）-msFoxn3由中山大学中山眼科中心向孟清教授惠赠；质粒XXM2.0、PsCatCh2.0由维尔茨堡大学生物中心分子植物生理学和生物物理学研究所高世强教授惠赠。HEKA膜片钳系统（德国HEKA公司），水平拉制仪MODEL P1000（美国Sutter公司），Mightex给光控制系统（加拿大Mightex公司），电生理试剂（美国Sigma公司），Trans5α化学感受态细胞（北京全式金生物技术有限公司），T4 DNA连接酶、高保真PCR试剂盒、EcoRⅤ-HF内切酶、EcoRⅠ-HF内切酶（美国New England Biolabs公司），质粒小提试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（北京天根生化科技有限公司），脂质体转染试剂（Lipofectamine 2000，美国Life Technologies公司），Gel Doc XR+凝胶成像系统、T100 PCR仪（美国Bio-RAD公司），K5600分光光度计（北京凯奥科技发展有限公司），EC 250-90电泳仪（美国Thermo公司），SPX-70BIII恒温培养箱（天津泰斯特仪器有限公司），5424R离心机（德国Eppendorf公司）。
1.2 质粒XXM2.0、PsCatCh2.0提取与验证
将吸附XXM2.0、PsCatCh2.0原始质粒的滤纸浸泡在含有200 μl DDH2O的1.5 ml离心管中，置于4 ℃冰箱中24 h，使质粒XXM2.0、PsCatCh2.0与DDH2O充分混合。分别吸取2 μl含质粒XXM2.0、PsCatCh2.0的DDH2O转入50 μl Trans5α化学感受态细胞中，－80 ℃保存，置于冰上溶解，混匀后置于冰中30 min，再迅速放入42 ℃水浴锅中水浴60 s，水浴结束后立即置于冰中3 min。在无菌工作台中各加入500 μl的细菌基础培养基，然后置于恒温摇床上培养1 h（37 ℃、220 r/min）。再置于离心机中以离心半径8.4 cm、转速5000 r/min离心3 min，使菌体沉淀。在无菌工作台中弃掉上清液400 μl，剩余液体充分和菌体混匀后铺板，培养皿正置放入37 ℃生化培养箱，待培养皿中液体培养基干燥后将其倒扣，继续在37 ℃生化培养箱中过夜培养12～16 h（根据菌落大小而定）。将生长良好的单一菌落挑入10 ml含氨苄霉素的细菌基础培养基中，在恒温摇床上培养12 h（37 ℃、220 r/min）。若菌落扩大、培养生长良好则可见液体培养基变混浊。将扩大培养后的菌液进行质粒小提，实验方法参考TIANGEN质粒小提试剂盒（离心柱型）、目录号DP103的实验步骤进行。提取质粒XXM2.0、PsCatCh2.0的测序验证由武汉擎科生物技术有限公司完成。XXM2.0正向引物序列5′-ATAGATACTCGCCCACCATGCGACCCCAAATACTCCTCTT-3′，反向引物序列5′-ATAGAATTCTCTAGAACTAGTGTCGACAACAT-3′；PsCatCh2.0正向引物序列5′-ATAGATATCGCCGCCACCATGCGACCCCAAATACTCCTCT-3′，反向引物序列5′-ATAGAATTCTGCCCGGTTCGCGTAGGTCTTA-3′。
1.3 质粒XXM2.0、PsCatCh2.0、pCIG（c）-msFoxn3酶切与连接
参照pCIG（c）-msFoxn3（图1A）所含的酶切位点EcoRⅠ和EcoRⅤ，设计包含酶切位点EcoRⅠ和EcoRⅤ的XXM2.0和PsCatCh2.0的引物序列如上。用高保真PCR试剂盒将XXM2.0和PsCatCh2.0序列进行扩增，2倍Q5高保真反应酶混合物25 μl，正向引物和反向引物各2.5 μl，质粒XXM2.0和PsCatCh2.0各2 μl，剩余用无核酸酶水补齐至50 μl，得到含有酶切位点EcoRⅠ和EcoRⅤ的XXM2.0和PsCatCh2.0序列（图1B）。将高保真扩增后的XXM2.0和PsCatCh2.0序列进行EcoRⅠ和EcoRⅤ酶切。酶切条件为XXM2.0和PsCatCh2.0各1 μg，分别加入EcoRⅠ-HF和EcoRⅤ-HF限制性内切酶1 μl，10倍反应缓冲液5 μl，用DDH2O补齐至总体积50 μl，在37 ℃水浴锅中酶切6 h。pCIG（c）-msFoxn3质粒也用相同条件酶切。质粒XXM2.0、PsCatCh2.0、pCIG（c）-msFoxn3的酶切产物用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收，回收实验方法参考TIANGEN普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）、目录号DP209的实验步骤进行。将回收的XXM2.0、PsCatCh2.0序列片段及pCIG（c）-msFoxn3框架用T4 DNA连接酶（浓度400 000 U/ml）进行连接，因EcoRⅠ-HF限制性内切酶酶切的DNA为粘性末端，而EcoRⅤ-HF限制性内切酶酶切的DNA为平滑末端，故实验条件统一为20 μl的反应体系中加入1 μl的T4 DNA连接酶，25 ℃下反应2 h。酶连接反应完成后分别将pCIG（c）-msFoxn3-XXM2.0 和pCIG（c）-msFoxn3-PsCatCh2.0连接的产物转入Trans5α化学感受态细胞中，然后进行单菌落扩大培养、质粒提取及测序验证，该步骤同前。
图1
pCIG（c）- msFoxn3-XXM2.0、pCIG（c）- msFoxn3-PsCatCh2.0质粒构建示意图。1A示质粒pCIG（c）-msFoxn3的结构，包含酶切位点EcoRⅠ、EcoRⅤ，筛选基因氨苄青霉素（amp）及报告基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）；1B示XXM2.0、PsCatCh2.0片段两端引入酶切位点EcoRⅠ、EcoRⅤ
1.4 细胞系HEK 293T的培养与DNA转染
HEK 293T细胞首先种植在5 ml含有10%胎牛血清、1倍DMEM、100 U/ml青霉素G、100 μg链霉素培养基的6 cm培养皿中，置于37 ℃、95%空气、5%CO2的生化培养箱中进行传代培养。待HEK 293T细胞铺满90%左右的培养皿后，将HEK 293T细胞转入含有包被明胶的玻片的24孔板中培养，所含培养基与上述相同，培养24 h后进行质粒转染。测序验证通过的质粒pCIG（c）-msFoxn3-XXM2.0和pCIG（c）-msFoxn3-PsCatCh2.0各2 μg加入250 μl的Opti-MEM培养基中，3 μl的Lipofectamine 2000加入另外250 μl的Opti-MEM培养基中，然后将含有质粒和Lipofectamine 2000的Opti-MEM培养基充分混合，室温放置15 min，使Lipofectamine 2000试剂充分包裹质粒。将24孔板中的培养基吸出，然后将混合充分的500 μl Opti-MEM培养基加入24孔板中，放入生化培养箱培养6 h。转染完成后将500 μl的Opti-MEM培养基吸出，加入500 μl含1%胎牛血清、1倍DMEM、100 U/ml青霉素G及100 μg链霉素的低血清培养基，继续培养48 h。培养完成后用荧光显微镜观察表达情况，再进行电生理实验。
1.5 全细胞模式膜片钳记录对光反应
转染后继续培养48 h后的HEK 293T细胞在恒定室温25 ℃条件下进行全细胞电压钳模式记录。细胞外液140 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、2 mmol/L CaCl2、20 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、16 mmol/L葡萄糖，用NaOH将PH调至7.4，置于室温；细胞内液115 mmol/L CsCH3O3、20 mmol/L CsCl、2.5 mmol/L MgCl2、0.6 mmol/L乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸、10 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、4 mmol/L腺苷5ˊ-三磷酸镁盐、0.4 mmol/L鸟苷5ˊ-三磷酸钠盐、10 mmol/L磷酸肌酸，用CsOH将PH调至7.2，置于冰上。实验前30 min将细胞外液用100% O2进行预充氧。用水平拉制仪拉制玻璃微电极，电阻大小为6～8 MΩ。转染XXM2.0和PsCatCh2.0的HEK 293T细胞置于细胞外液中暗适应30 min，待细胞状态稳定后进行膜片钳实验。为验证XXM2.0和PsCatCh2.0的光敏感性，依次在2.7×1016、4.7×1015、6.4×1014 photons/（cm2·s）光强下记录电流，并在2.7×1016 photons/（cm2·s）的光强下让XXM2.0和PsCatCh2.0在1 s光刺激后充分恢复，在Clampfit 10.6软件中分析开放时间常数和关闭时间常数。为探讨XXM2.0和PsCatCh2.0的对光响应频率，设置2、4、8、16、32 Hz脉冲光刺激，并在重复刺激固定长间隔4000 ms和短间隔200 ms分析电流衰减情况。光源为Mightex外置光纤（470 nm），刺激时间由BioLED控制软件设置，具体光强由光功率计测量。
1.6 统计学方法
采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，数据均用均数±标准差（
）表示。组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 以pCIG（c）-msFoxn3为载体构建的XXM2.0、PsCatCh2.0质粒鉴定
载体质粒pCIG（c）-msFoxn3含有EcoRⅠ、EcoRⅤ的酶切位点、EGFP、amp，碱基数大约为6200 bp。pCIG（c）-msFoxn3-XXM2.0和pCIG（c）-msFoxn3-PsCatCh2.0质粒均可被限制性内切酶EcoRⅠ、EcoRⅤ切开，条带大小符合载体质粒pCIG（c）-msFoxn3及目的片段XXM2.0、PsCatCh2.0的长度（图2）。构建的pCIG（c）-msFoxn3-XXM2.0和pCIG（c）-msFoxn3-PsCatCh2.0质粒所含序列均用基因测序验证。
图2
T4 DNA连接酶连接成功后再用限制性内切酶EcoRⅠ、EcoRⅤ酶切验证的凝胶扫描图
2.2 XXM2.0、PsCatCh2.0的光敏感性
新型光敏蛋白XXM2.0和PsCatCh2.0光刺激后产生的电流表现出光强依赖性，光强越大电流越大。在强光刺激下光敏蛋白XXM2.0和PsCatCh2.0表现出明显的峰电流和平台电流，随着光强降低，峰电流逐渐减少至和平台电流相等。在光强为2.7×1016 photons/（cm2·s）的刺激下，XXM2.0、PsCatCh2.0的峰电流分别为（424.7±589.9）、（117.8±60.6）pA，平台电流分别为（397.3±528.9）、（105.4±5.6）pA；两者峰电流和平台电流比较，差异无统计学意义（t=1.16、1.30，P=0.31、0.26）。在光强为4.7×1015 photons/（cm2·s）的刺激下，XXM2.0、PsCatCh2.0的峰电流分别为（192.9±262.4）、（39.97±15.1）pA，平台电流分别为（192.6±262.4）、（38.6±15.1）pA；两者峰电流和平台电流比较，差异无统计学意义（t=1.24、1.23，P=0.28、0.29）。在光强为6.4×1014 photons/（cm2·s）的刺激下，XXM2.0、PsCatCh2.0的峰电流分别为（92.8±142.0）、（13.9±5.6）pA，平台电流分别为（92.8±142.0）、（13.9±5.6）pA；两者峰电流和平台电流比较，差异无统计学意义（t=1.24、1.24，P=0.28、0.29）（图3）。
图3
XXM2.0和PsCatCh2.0在470 nm蓝光、1 s给光时间条件下的光敏感性。3A示不同光强条件下的电流图；3B示不同光强条件下的峰电流；3C示不同光强条件下的平台电流
2.3 XXM2.0、PsCatCh2.0的动力学特征
在光强为2.7×1016 photons/（cm2·s）的470 nm蓝光刺激下，XXM2.0、PsCatCh2.0的开放时间常数分别为（23.9±6.7）、（2.4±0.8）ms，关闭时间常数分别为（5 803.0±568.2）、（219.9±25.6）ms；两者比较，XXM2.0的开放时间常数、关闭时间常数值均较PsCatCh2.0大，差异均有统计学意义（t=7.10、31.60，P=0.00、0.00）（图4）。
图4
XXM2.0和PsCatCh2.0在470 nm蓝光、1 s给光时间条件下的动力学特征。4A示光强2.7×1016 photons/（cm2·s）条件下的电流图；4B示XXM2.0和PsCatCh2.0的开放时间常数比较；4C示XXM2.0和PsCatCh 2.0的关闭时间常数比较。***P＜0.001
2.4 XXM2.0、PsCatCh2.0的响应频率
在2～32 Hz的脉冲光刺激下，XXM2.0和PsCatCh2.0均能响应32 Hz的高频脉冲光刺激（图5A）。由于XXM2.0的关闭时间常数要明显慢于PsCatCh2.0，所以XXM2.0的电流还不能很好地恢复到基线水平又进一步增大，并且电流恢复程度逐渐变小。在高频率的光刺激下，XXM2.0及PsCatCh2.0均没有再出现明显的峰电流。在470 nm光强为2.7×1016 photons/（cm2·s）的1 s重复光刺激、长间隔4000 ms的条件下，XXM2.0、PsCatCh2.0的电流衰减率分别为0.08±0.04、0.08±0.20，两者之间的差异无统计学意义（t=0.00，P=1.00）；再进行200 ms的稍短时间间隔的刺激下，XXM2.0、PsCatCh2.0的电流衰减率分别为0.08±0.05、0.07±0.02，两者之间的差异无统计学意义（t=0.19，P=0.83）（图5B～5D）。
图5
XXM2.0和PsCatCh2.0在光强为2.7×1016 photons/（cm2·s）的470 nm蓝光条件下以及光刺激脉冲在2、4、8、16、32 Hz频率下的响应频率及重复光刺激电流衰减情况。5A示响应频率电流图；5B示稍长间隔（4000 ms）及稍短间隔（200 ms）的重复光刺激下的电流图；5C示稍长间隔（4000 ms）的重复光刺激下电流衰减率比较；5D示XXM2.0和PsCatCh2.0稍短间隔（200 ms）的重复光刺激下电流衰减率比较
3 讨论
应用于视觉功能恢复的光遗传学工具主要包括微生物光敏蛋白和哺乳动物光敏蛋白。人视网膜的安全光强阈值与波长相关，波长越短，光子能量越强，就更容易导致视网膜光毒性损害。视觉信号处理依赖高频率的时空分辨率，以现在人们熟知的电影播放帧数为例，为24帧/s，即24 Hz，如低于24 Hz就会使人感觉画面不连续[16]。ChR2作为最早应用于视觉恢复的微生物光敏蛋白，最佳激活波长在470 nm左右，光强为1017～1018 photons/（cm2·s），超过了470 nm蓝光应用在视网膜上的安全阈值7.62×1014 photons/（cm2·s） [16-17]。相反，哺乳动物光敏蛋白视紫红质和黑视蛋白在室内的环境光强下就可激活，但需要数百毫秒甚至数十秒的时间才能充分恢复光敏感性，又不能满足视觉信号的空间分辨率[18-21]（图6）。所以，目前应用于视觉恢复的光敏蛋白不能很好平衡光敏感性和动力学来满足视觉信号需求。因此，我们需要一类新型的光敏蛋白能同时兼顾高敏感性、快动力学，并在高频率响应下保持电流信号的稳定。
图6
微生物光敏蛋白和哺乳动物光敏蛋白的激活光波长、可激活光强范围及对光响应频率。470 nm波长蓝光对视网膜的安全光强范围，最大为7.62×1014 photons/（cm2·s）；500 nm波长绿光对视网膜的安全光强范围，最大为5.03×1015 photons/（cm2·s）；590 nm波长黄橙光对视网膜的安全光强范围，最大为5.94×1017photons/（cm2·s）
随着基因工程技术的发展，改造微生物光敏蛋白，提升生物学性能变得可能。策略一是延长光敏蛋白关闭时间常数。如ChR2突变体ChR2 L132C、T159C、L123C/T159C和L123C/T159S，它们的关闭时间常数在45 ms到1.4 s之间，空间响应频率不足20 Hz[22]。虽然光敏感性比ChR2提升了15～20倍，但依然不足以降低对视网膜的光毒性损害[17]。目前应用于视觉功能恢复的光敏感性最高的ChR突变体是CoChR-H94E/L112C/K264T，可以在1012 photons/（cm2·s）的室内环境光强下被激活，但关闭时间常数为723 ms，响应频率仅10 Hz左右[23]。所以，通过延长关闭时间常数的策略来提高光敏感性就导致了响应频率降低，在视觉功能恢复中只能满足光强要求。二是红移激活波长，波长越长，视网膜可接受的光强就越强。ReaChR的激活波长从470 nm红移至590 nm，590 nm的黄橙光对视网膜的安全阈值为5.94×1017 photons/（cm2·s），从而可以利用处于对视网膜安全阈值内的黄橙光来激活ReaChR，且ReaChR的响应频率可达30 Hz，可满足视觉信号处理的时空分辨率[16]。三是改变光敏蛋白通道离子通透性。如对Ca2+通透性增加的ChR突变体CatCh。光敏蛋白ChR2的离子通道是非选择性的阳离子通道，且以Na+为主。CatCh的关闭时间常数在16 ms左右，与ChR2的关闭时间常数10 ms差别不大，但光敏感性与ChR2相比提高了70倍，其主要原因就是CatCh提高了6倍的Ca2+通透性[20]。在哺乳动物光敏蛋白上，由于其光敏感性要比微生物光敏蛋白高103甚至104倍[24-25]，所以利用光遗传学技术恢复视觉功能的最大限制是动力学不足。为了弥补黑视蛋白在视觉信号空间分辨率的不足，将mGluR6和黑视蛋白嵌合形成新光敏蛋白Opto-mGluR6。mGluR6是视网膜ON型双极细胞的特异性谷氨酸受体，可以通过结合从光感受器细胞到TRPM1阳离子通道的谷氨酸信号来调节光反应，并且可以结合细胞内G蛋白偶联的第二信使级联反应大大增强谷氨酸信号[26-27]。所以Opto-mGluR6在一定程度上改善了黑视蛋白动力学不足。除了视紫红质和黑视蛋白外，锥视蛋白尤其是对中等波长敏感的锥视蛋白，其光敏感性和视紫红质差不多，光刺激后达到峰电流的时间比视紫红质快3倍，关闭时间常数时间要快7倍，但可响应的光刺激脉冲只有2 Hz[28]。
XXM2.0和PsCatCh2.0均可在视网膜安全阈值内的低光强6.4×1014 photons/（cm2·s）（470 nm）下被激活，并且XXM2.0的关闭时间常数显著大于PsCatCh2.0，所以XXM2.0具有更好的光敏感性。其次XXM2.0和PsCatCh2.0光敏蛋白均能以较小电流衰减来响应高频率光刺激（至少32 Hz），这也满足视觉信号处理所需的24 Hz。PsCatCh2.0是一个Ca2+、Na+通透性高的光敏蛋白，其Ca2+电流比CatCh要高4倍，在相同的光刺激条件下具有更快的响应频率和更大光电流，所以在利用光遗传学恢复视觉功能与CatCh相比更具优势。虽然XXM2.0的时间关闭常数在5803 ms，但依然可以响应32 Hz频率的光刺激并且电流衰减只有7%～8%，该性能要远远优于哺乳动物光敏蛋白视紫红质。但XXM2.0在响应脉冲光刺激的时候并不能充分恢复至基线水平，这一电流形式是否会影响视觉信号传导还得继续研究。
XXM2.0和PsCatCh2.0作为新型的光敏蛋白，具有较高的光敏感性和高频率的对光响应，均可作为视觉恢复的光遗传学工具使用，可以有效降低视网膜光毒性损害。由于XXM2.0和PsCatCh2.0的光敏感性均在体外检测，真正应用到动物模型或临床试验上还要考虑光强通过角膜和晶状体的损耗，所以通过基因工程改造具有更高光敏感性的光敏蛋白具有重要意义，如提升Ca2+等二价离子的通透性、离子通道的电导率、靶向细胞膜的表达能力及红移激活光波谱来提高光敏感性而不影响光敏蛋白的动力学特征。随着基因工程技术的进步，在将来会有越来越多的性能优越的光遗传学工具应用到视觉功能恢复中来。
遗传性视网膜疾病（IRDs）和老年性黄斑变性（AMD）会导致视网膜光感受器细胞凋亡，最终可致视力完全丧失。虽然IRDs和AMD光感受器细胞凋亡，但视网膜内核层及RGC层仍可在一定的时间窗内保持结构功能的完整并可向大脑视觉中枢传递信息。目前，至少有270个基因位点突变与IRDs相关，而且已知AMD是由多基因突变导致[1-2]。其治疗手段包括干细胞移植、基因治疗、视网膜假体植入及光遗传学等[3-7]。光遗传学正是利用退行性病变视网膜剩余结构的完整性，以腺相关病毒（AAV）为载体将光敏蛋白靶向表达在视锥细胞[8]（退行性病变早期）、ON型双极细胞或RGC（退行性病变中晚期）来恢复视网膜的光反应[9-10]。除此之外还可结合干细胞、虚拟现实系统和全息成像技术等来恢复视觉功能[11-13]。光遗传学作为一个不依赖突变位点基因功能，并能在单细胞水平响应光刺激的治疗策略，在治疗IRDs和AMD上有很大潜力[14-15]。然而，光遗传学工具的生物学性能一直是限制视觉功能恢复的关键因素，尤其是光敏感性和动力学。目前，应用于视觉功能恢复的光遗传学工具包括微生物和哺乳动物光敏蛋白两大类，但均因其各自的不足受到限制。随着基因工程技术的进步，改造微生物光敏蛋白的特性，提高光敏感性变得可行。为此，本研究初步探讨了新型光遗传学工具Channelrhodopsin-XXM2.0和Channelrhodopsin-PsCatCh2.0的光敏感性及动力学特征，分析两者是否可用于光遗传学视觉功能的恢复。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要实验材料
HEK 293T细胞系、质粒pCIG（c）-msFoxn3由中山大学中山眼科中心向孟清教授惠赠；质粒XXM2.0、PsCatCh2.0由维尔茨堡大学生物中心分子植物生理学和生物物理学研究所高世强教授惠赠。HEKA膜片钳系统（德国HEKA公司），水平拉制仪MODEL P1000（美国Sutter公司），Mightex给光控制系统（加拿大Mightex公司），电生理试剂（美国Sigma公司），Trans5α化学感受态细胞（北京全式金生物技术有限公司），T4 DNA连接酶、高保真PCR试剂盒、EcoRⅤ-HF内切酶、EcoRⅠ-HF内切酶（美国New England Biolabs公司），质粒小提试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（北京天根生化科技有限公司），脂质体转染试剂（Lipofectamine 2000，美国Life Technologies公司），Gel Doc XR+凝胶成像系统、T100 PCR仪（美国Bio-RAD公司），K5600分光光度计（北京凯奥科技发展有限公司），EC 250-90电泳仪（美国Thermo公司），SPX-70BIII恒温培养箱（天津泰斯特仪器有限公司），5424R离心机（德国Eppendorf公司）。
1.2 质粒XXM2.0、PsCatCh2.0提取与验证
将吸附XXM2.0、PsCatCh2.0原始质粒的滤纸浸泡在含有200 μl DDH2O的1.5 ml离心管中，置于4 ℃冰箱中24 h，使质粒XXM2.0、PsCatCh2.0与DDH2O充分混合。分别吸取2 μl含质粒XXM2.0、PsCatCh2.0的DDH2O转入50 μl Trans5α化学感受态细胞中，－80 ℃保存，置于冰上溶解，混匀后置于冰中30 min，再迅速放入42 ℃水浴锅中水浴60 s，水浴结束后立即置于冰中3 min。在无菌工作台中各加入500 μl的细菌基础培养基，然后置于恒温摇床上培养1 h（37 ℃、220 r/min）。再置于离心机中以离心半径8.4 cm、转速5000 r/min离心3 min，使菌体沉淀。在无菌工作台中弃掉上清液400 μl，剩余液体充分和菌体混匀后铺板，培养皿正置放入37 ℃生化培养箱，待培养皿中液体培养基干燥后将其倒扣，继续在37 ℃生化培养箱中过夜培养12～16 h（根据菌落大小而定）。将生长良好的单一菌落挑入10 ml含氨苄霉素的细菌基础培养基中，在恒温摇床上培养12 h（37 ℃、220 r/min）。若菌落扩大、培养生长良好则可见液体培养基变混浊。将扩大培养后的菌液进行质粒小提，实验方法参考TIANGEN质粒小提试剂盒（离心柱型）、目录号DP103的实验步骤进行。提取质粒XXM2.0、PsCatCh2.0的测序验证由武汉擎科生物技术有限公司完成。XXM2.0正向引物序列5′-ATAGATACTCGCCCACCATGCGACCCCAAATACTCCTCTT-3′，反向引物序列5′-ATAGAATTCTCTAGAACTAGTGTCGACAACAT-3′；PsCatCh2.0正向引物序列5′-ATAGATATCGCCGCCACCATGCGACCCCAAATACTCCTCT-3′，反向引物序列5′-ATAGAATTCTGCCCGGTTCGCGTAGGTCTTA-3′。
1.3 质粒XXM2.0、PsCatCh2.0、pCIG（c）-msFoxn3酶切与连接
参照pCIG（c）-msFoxn3（图1A）所含的酶切位点EcoRⅠ和EcoRⅤ，设计包含酶切位点EcoRⅠ和EcoRⅤ的XXM2.0和PsCatCh2.0的引物序列如上。用高保真PCR试剂盒将XXM2.0和PsCatCh2.0序列进行扩增，2倍Q5高保真反应酶混合物25 μl，正向引物和反向引物各2.5 μl，质粒XXM2.0和PsCatCh2.0各2 μl，剩余用无核酸酶水补齐至50 μl，得到含有酶切位点EcoRⅠ和EcoRⅤ的XXM2.0和PsCatCh2.0序列（图1B）。将高保真扩增后的XXM2.0和PsCatCh2.0序列进行EcoRⅠ和EcoRⅤ酶切。酶切条件为XXM2.0和PsCatCh2.0各1 μg，分别加入EcoRⅠ-HF和EcoRⅤ-HF限制性内切酶1 μl，10倍反应缓冲液5 μl，用DDH2O补齐至总体积50 μl，在37 ℃水浴锅中酶切6 h。pCIG（c）-msFoxn3质粒也用相同条件酶切。质粒XXM2.0、PsCatCh2.0、pCIG（c）-msFoxn3的酶切产物用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收，回收实验方法参考TIANGEN普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）、目录号DP209的实验步骤进行。将回收的XXM2.0、PsCatCh2.0序列片段及pCIG（c）-msFoxn3框架用T4 DNA连接酶（浓度400 000 U/ml）进行连接，因EcoRⅠ-HF限制性内切酶酶切的DNA为粘性末端，而EcoRⅤ-HF限制性内切酶酶切的DNA为平滑末端，故实验条件统一为20 μl的反应体系中加入1 μl的T4 DNA连接酶，25 ℃下反应2 h。酶连接反应完成后分别将pCIG（c）-msFoxn3-XXM2.0 和pCIG（c）-msFoxn3-PsCatCh2.0连接的产物转入Trans5α化学感受态细胞中，然后进行单菌落扩大培养、质粒提取及测序验证，该步骤同前。
图1
pCIG（c）- msFoxn3-XXM2.0、pCIG（c）- msFoxn3-PsCatCh2.0质粒构建示意图。1A示质粒pCIG（c）-msFoxn3的结构，包含酶切位点EcoRⅠ、EcoRⅤ，筛选基因氨苄青霉素（amp）及报告基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）；1B示XXM2.0、PsCatCh2.0片段两端引入酶切位点EcoRⅠ、EcoRⅤ
1.4 细胞系HEK 293T的培养与DNA转染
HEK 293T细胞首先种植在5 ml含有10%胎牛血清、1倍DMEM、100 U/ml青霉素G、100 μg链霉素培养基的6 cm培养皿中，置于37 ℃、95%空气、5%CO2的生化培养箱中进行传代培养。待HEK 293T细胞铺满90%左右的培养皿后，将HEK 293T细胞转入含有包被明胶的玻片的24孔板中培养，所含培养基与上述相同，培养24 h后进行质粒转染。测序验证通过的质粒pCIG（c）-msFoxn3-XXM2.0和pCIG（c）-msFoxn3-PsCatCh2.0各2 μg加入250 μl的Opti-MEM培养基中，3 μl的Lipofectamine 2000加入另外250 μl的Opti-MEM培养基中，然后将含有质粒和Lipofectamine 2000的Opti-MEM培养基充分混合，室温放置15 min，使Lipofectamine 2000试剂充分包裹质粒。将24孔板中的培养基吸出，然后将混合充分的500 μl Opti-MEM培养基加入24孔板中，放入生化培养箱培养6 h。转染完成后将500 μl的Opti-MEM培养基吸出，加入500 μl含1%胎牛血清、1倍DMEM、100 U/ml青霉素G及100 μg链霉素的低血清培养基，继续培养48 h。培养完成后用荧光显微镜观察表达情况，再进行电生理实验。
1.5 全细胞模式膜片钳记录对光反应
转染后继续培养48 h后的HEK 293T细胞在恒定室温25 ℃条件下进行全细胞电压钳模式记录。细胞外液140 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、2 mmol/L CaCl2、20 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、16 mmol/L葡萄糖，用NaOH将PH调至7.4，置于室温；细胞内液115 mmol/L CsCH3O3、20 mmol/L CsCl、2.5 mmol/L MgCl2、0.6 mmol/L乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸、10 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、4 mmol/L腺苷5ˊ-三磷酸镁盐、0.4 mmol/L鸟苷5ˊ-三磷酸钠盐、10 mmol/L磷酸肌酸，用CsOH将PH调至7.2，置于冰上。实验前30 min将细胞外液用100% O2进行预充氧。用水平拉制仪拉制玻璃微电极，电阻大小为6～8 MΩ。转染XXM2.0和PsCatCh2.0的HEK 293T细胞置于细胞外液中暗适应30 min，待细胞状态稳定后进行膜片钳实验。为验证XXM2.0和PsCatCh2.0的光敏感性，依次在2.7×1016、4.7×1015、6.4×1014 photons/（cm2·s）光强下记录电流，并在2.7×1016 photons/（cm2·s）的光强下让XXM2.0和PsCatCh2.0在1 s光刺激后充分恢复，在Clampfit 10.6软件中分析开放时间常数和关闭时间常数。为探讨XXM2.0和PsCatCh2.0的对光响应频率，设置2、4、8、16、32 Hz脉冲光刺激，并在重复刺激固定长间隔4000 ms和短间隔200 ms分析电流衰减情况。光源为Mightex外置光纤（470 nm），刺激时间由BioLED控制软件设置，具体光强由光功率计测量。
1.6 统计学方法
采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，数据均用均数±标准差（）表示。组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 以pCIG（c）-msFoxn3为载体构建的XXM2.0、PsCatCh2.0质粒鉴定
载体质粒pCIG（c）-msFoxn3含有EcoRⅠ、EcoRⅤ的酶切位点、EGFP、amp，碱基数大约为6200 bp。pCIG（c）-msFoxn3-XXM2.0和pCIG（c）-msFoxn3-PsCatCh2.0质粒均可被限制性内切酶EcoRⅠ、EcoRⅤ切开，条带大小符合载体质粒pCIG（c）-msFoxn3及目的片段XXM2.0、PsCatCh2.0的长度（图2）。构建的pCIG（c）-msFoxn3-XXM2.0和pCIG（c）-msFoxn3-PsCatCh2.0质粒所含序列均用基因测序验证。
图2
T4 DNA连接酶连接成功后再用限制性内切酶EcoRⅠ、EcoRⅤ酶切验证的凝胶扫描图
2.2 XXM2.0、PsCatCh2.0的光敏感性
新型光敏蛋白XXM2.0和PsCatCh2.0光刺激后产生的电流表现出光强依赖性，光强越大电流越大。在强光刺激下光敏蛋白XXM2.0和PsCatCh2.0表现出明显的峰电流和平台电流，随着光强降低，峰电流逐渐减少至和平台电流相等。在光强为2.7×1016 photons/（cm2·s）的刺激下，XXM2.0、PsCatCh2.0的峰电流分别为（424.7±589.9）、（117.8±60.6）pA，平台电流分别为（397.3±528.9）、（105.4±5.6）pA；两者峰电流和平台电流比较，差异无统计学意义（t=1.16、1.30，P=0.31、0.26）。在光强为4.7×1015 photons/（cm2·s）的刺激下，XXM2.0、PsCatCh2.0的峰电流分别为（192.9±262.4）、（39.97±15.1）pA，平台电流分别为（192.6±262.4）、（38.6±15.1）pA；两者峰电流和平台电流比较，差异无统计学意义（t=1.24、1.23，P=0.28、0.29）。在光强为6.4×1014 photons/（cm2·s）的刺激下，XXM2.0、PsCatCh2.0的峰电流分别为（92.8±142.0）、（13.9±5.6）pA，平台电流分别为（92.8±142.0）、（13.9±5.6）pA；两者峰电流和平台电流比较，差异无统计学意义（t=1.24、1.24，P=0.28、0.29）（图3）。
图3
XXM2.0和PsCatCh2.0在470 nm蓝光、1 s给光时间条件下的光敏感性。3A示不同光强条件下的电流图；3B示不同光强条件下的峰电流；3C示不同光强条件下的平台电流
2.3 XXM2.0、PsCatCh2.0的动力学特征
在光强为2.7×1016 photons/（cm2·s）的470 nm蓝光刺激下，XXM2.0、PsCatCh2.0的开放时间常数分别为（23.9±6.7）、（2.4±0.8）ms，关闭时间常数分别为（5 803.0±568.2）、（219.9±25.6）ms；两者比较，XXM2.0的开放时间常数、关闭时间常数值均较PsCatCh2.0大，差异均有统计学意义（t=7.10、31.60，P=0.00、0.00）（图4）。
图4
XXM2.0和PsCatCh2.0在470 nm蓝光、1 s给光时间条件下的动力学特征。4A示光强2.7×1016 photons/（cm2·s）条件下的电流图；4B示XXM2.0和PsCatCh2.0的开放时间常数比较；4C示XXM2.0和PsCatCh 2.0的关闭时间常数比较。***P＜0.001
2.4 XXM2.0、PsCatCh2.0的响应频率
在2～32 Hz的脉冲光刺激下，XXM2.0和PsCatCh2.0均能响应32 Hz的高频脉冲光刺激（图5A）。由于XXM2.0的关闭时间常数要明显慢于PsCatCh2.0，所以XXM2.0的电流还不能很好地恢复到基线水平又进一步增大，并且电流恢复程度逐渐变小。在高频率的光刺激下，XXM2.0及PsCatCh2.0均没有再出现明显的峰电流。在470 nm光强为2.7×1016 photons/（cm2·s）的1 s重复光刺激、长间隔4000 ms的条件下，XXM2.0、PsCatCh2.0的电流衰减率分别为0.08±0.04、0.08±0.20，两者之间的差异无统计学意义（t=0.00，P=1.00）；再进行200 ms的稍短时间间隔的刺激下，XXM2.0、PsCatCh2.0的电流衰减率分别为0.08±0.05、0.07±0.02，两者之间的差异无统计学意义（t=0.19，P=0.83）（图5B～5D）。
图5
XXM2.0和PsCatCh2.0在光强为2.7×1016 photons/（cm2·s）的470 nm蓝光条件下以及光刺激脉冲在2、4、8、16、32 Hz频率下的响应频率及重复光刺激电流衰减情况。5A示响应频率电流图；5B示稍长间隔（4000 ms）及稍短间隔（200 ms）的重复光刺激下的电流图；5C示稍长间隔（4000 ms）的重复光刺激下电流衰减率比较；5D示XXM2.0和PsCatCh2.0稍短间隔（200 ms）的重复光刺激下电流衰减率比较
3 讨论
应用于视觉功能恢复的光遗传学工具主要包括微生物光敏蛋白和哺乳动物光敏蛋白。人视网膜的安全光强阈值与波长相关，波长越短，光子能量越强，就更容易导致视网膜光毒性损害。视觉信号处理依赖高频率的时空分辨率，以现在人们熟知的电影播放帧数为例，为24帧/s，即24 Hz，如低于24 Hz就会使人感觉画面不连续[16]。ChR2作为最早应用于视觉恢复的微生物光敏蛋白，最佳激活波长在470 nm左右，光强为1017～1018 photons/（cm2·s），超过了470 nm蓝光应用在视网膜上的安全阈值7.62×1014 photons/（cm2·s） [16-17]。相反，哺乳动物光敏蛋白视紫红质和黑视蛋白在室内的环境光强下就可激活，但需要数百毫秒甚至数十秒的时间才能充分恢复光敏感性，又不能满足视觉信号的空间分辨率[18-21]（图6）。所以，目前应用于视觉恢复的光敏蛋白不能很好平衡光敏感性和动力学来满足视觉信号需求。因此，我们需要一类新型的光敏蛋白能同时兼顾高敏感性、快动力学，并在高频率响应下保持电流信号的稳定。
图6
微生物光敏蛋白和哺乳动物光敏蛋白的激活光波长、可激活光强范围及对光响应频率。470 nm波长蓝光对视网膜的安全光强范围，最大为7.62×1014 photons/（cm2·s）；500 nm波长绿光对视网膜的安全光强范围，最大为5.03×1015 photons/（cm2·s）；590 nm波长黄橙光对视网膜的安全光强范围，最大为5.94×1017photons/（cm2·s）
随着基因工程技术的发展，改造微生物光敏蛋白，提升生物学性能变得可能。策略一是延长光敏蛋白关闭时间常数。如ChR2突变体ChR2 L132C、T159C、L123C/T159C和L123C/T159S，它们的关闭时间常数在45 ms到1.4 s之间，空间响应频率不足20 Hz[22]。虽然光敏感性比ChR2提升了15～20倍，但依然不足以降低对视网膜的光毒性损害[17]。目前应用于视觉功能恢复的光敏感性最高的ChR突变体是CoChR-H94E/L112C/K264T，可以在1012 photons/（cm2·s）的室内环境光强下被激活，但关闭时间常数为723 ms，响应频率仅10 Hz左右[23]。所以，通过延长关闭时间常数的策略来提高光敏感性就导致了响应频率降低，在视觉功能恢复中只能满足光强要求。二是红移激活波长，波长越长，视网膜可接受的光强就越强。ReaChR的激活波长从470 nm红移至590 nm，590 nm的黄橙光对视网膜的安全阈值为5.94×1017 photons/（cm2·s），从而可以利用处于对视网膜安全阈值内的黄橙光来激活ReaChR，且ReaChR的响应频率可达30 Hz，可满足视觉信号处理的时空分辨率[16]。三是改变光敏蛋白通道离子通透性。如对Ca2+通透性增加的ChR突变体CatCh。光敏蛋白ChR2的离子通道是非选择性的阳离子通道，且以Na+为主。CatCh的关闭时间常数在16 ms左右，与ChR2的关闭时间常数10 ms差别不大，但光敏感性与ChR2相比提高了70倍，其主要原因就是CatCh提高了6倍的Ca2+通透性[20]。在哺乳动物光敏蛋白上，由于其光敏感性要比微生物光敏蛋白高103甚至104倍[24-25]，所以利用光遗传学技术恢复视觉功能的最大限制是动力学不足。为了弥补黑视蛋白在视觉信号空间分辨率的不足，将mGluR6和黑视蛋白嵌合形成新光敏蛋白Opto-mGluR6。mGluR6是视网膜ON型双极细胞的特异性谷氨酸受体，可以通过结合从光感受器细胞到TRPM1阳离子通道的谷氨酸信号来调节光反应，并且可以结合细胞内G蛋白偶联的第二信使级联反应大大增强谷氨酸信号[26-27]。所以Opto-mGluR6在一定程度上改善了黑视蛋白动力学不足。除了视紫红质和黑视蛋白外，锥视蛋白尤其是对中等波长敏感的锥视蛋白，其光敏感性和视紫红质差不多，光刺激后达到峰电流的时间比视紫红质快3倍，关闭时间常数时间要快7倍，但可响应的光刺激脉冲只有2 Hz[28]。
XXM2.0和PsCatCh2.0均可在视网膜安全阈值内的低光强6.4×1014 photons/（cm2·s）（470 nm）下被激活，并且XXM2.0的关闭时间常数显著大于PsCatCh2.0，所以XXM2.0具有更好的光敏感性。其次XXM2.0和PsCatCh2.0光敏蛋白均能以较小电流衰减来响应高频率光刺激（至少32 Hz），这也满足视觉信号处理所需的24 Hz。PsCatCh2.0是一个Ca2+、Na+通透性高的光敏蛋白，其Ca2+电流比CatCh要高4倍，在相同的光刺激条件下具有更快的响应频率和更大光电流，所以在利用光遗传学恢复视觉功能与CatCh相比更具优势。虽然XXM2.0的时间关闭常数在5803 ms，但依然可以响应32 Hz频率的光刺激并且电流衰减只有7%～8%，该性能要远远优于哺乳动物光敏蛋白视紫红质。但XXM2.0在响应脉冲光刺激的时候并不能充分恢复至基线水平，这一电流形式是否会影响视觉信号传导还得继续研究。
XXM2.0和PsCatCh2.0作为新型的光敏蛋白，具有较高的光敏感性和高频率的对光响应，均可作为视觉恢复的光遗传学工具使用，可以有效降低视网膜光毒性损害。由于XXM2.0和PsCatCh2.0的光敏感性均在体外检测，真正应用到动物模型或临床试验上还要考虑光强通过角膜和晶状体的损耗，所以通过基因工程改造具有更高光敏感性的光敏蛋白具有重要意义，如提升Ca2+等二价离子的通透性、离子通道的电导率、靶向细胞膜的表达能力及红移激活光波谱来提高光敏感性而不影响光敏蛋白的动力学特征。随着基因工程技术的进步，在将来会有越来越多的性能优越的光遗传学工具应用到视觉功能恢复中来。
