引用本文： 支知娜, 孙翠敏, 傅芊, 陈斯, 周翔天. 小鼠形觉剥夺对不同类型视网膜神经节细胞形态的影响. 中华眼底病杂志, 2019, 35(5): 451-461. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2019.05.006 复制
屈光发育关键期，合适的视觉输入是正视化的关键因子[1-2]。RGC是视网膜上将视觉信号传递到中枢的唯一神经元。不同的视觉信号特征由不同的视网膜神经通路及相应的RGC来承担[3-5]。视觉信号可分为形觉信号和非形觉信号。形觉信号包括物体的形状、运动等特征，由传统的RGC传递；非形觉信号参与昼夜节律和瞳孔对光反射等视网膜功能，主要由感光RGC（ipRGC）进行传递[3-5]。形觉和非形觉视觉信号在近视的发生发展中均发挥了重要的作用。既往研究发现，超过一半的OFF瞬时性RGC和ON持续性RGC对远视性和近视性离焦的反应有所不同[6]；兔子形觉剥夺过程中RGC的数量减少[7]。这些研究结果证实，RGC功能和数量在近视发生的过程中发挥了作用。RGC的形态是其功能的基础。比如，局部边缘探测RGC的树突野小，分支密集；而ipRGC树突野大，分支疏松[8]。因此，RGC改变可以反应哪些RGC受形觉剥夺的影响而参与近视过程，以及不同类型的RGC及其所代表的通路是否在近视过程中发挥了不同作用值得深入研究。本研究观察分析了黄色荧光蛋白（YFP）转基因小鼠形觉剥夺对不同类型RGC形态的影响，以期为进一步明确近视的视网膜机制提供理论基础。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 实验动物及其基因型鉴定、实验设计
本实验所涉及动物饲养与处理均经温州医科大学动物伦理委员会审批通过，并遵循美国视觉与眼科学研究学会关于眼科和视觉研究中对动物的处理原则。60只B6.Cg-Tg（Thy1-YFP）HJrs/J转基因小鼠（YFP转基因小鼠）购自美国杰克逊实验室，繁殖于温州医科大学动物实验室（动物伦理批号WYDW2016-0348）。该小鼠特异性标记10%～30%的RGC。所有小鼠来自YFP转基因小鼠同窝仔，均在12 h光照/12 h黑暗的照明条件下饲养于标准透光鼠笼中，光照时间为8:00至20:00，环境温度（22±2）℃。可自由摄食、进水。每3天更换清洁笼具及垫料以保持饲养环境卫生。
剪取小鼠尾巴提取DNA，经PCR后电泳。YFP转基因小鼠由C57BL/6J为背景，利用转基因细菌人工染色体技术获得。在表达胸腺细胞抗原1（Thy1）的基因片段上加上表达YFP的基因片段，杂合子小鼠体内所有表达Thy1的细胞均表达YFP。YFP阳性小鼠Thy1基因片段长度为415 bp，YFP阴性小鼠Thy1基因片段长度为324 bp。
将60只小鼠随机分为形觉剥夺组及对照组，分别为28、32只。形觉剥夺组小鼠右眼通过遮盖片进行单眼遮盖2周作为剥夺眼，同时纳入对侧眼进行分析。对照组小鼠不作任何处理，取右眼作为对照眼。形觉剥夺前及形觉剥夺后2周，测量两组小鼠屈光度及眼轴相关参数；采用免疫组织化学染色对视网膜上表达YFP的RGC进行三维重构和形态分析；采用免疫荧光染色对RGC数量进行统计。
1.2 实验方法
采用自行搭建的红外偏心摄影验光仪检测两组小鼠的屈光度，每只眼连续测量3次，取平均值。采用Cinescan A/B超声诊断仪（法国Quantel Medical公司）中的A超探头进行测量，检测参数包括前房深度、晶状体厚度、玻璃体腔深度和眼轴长度。测量前2～3 min用0.5%盐酸丙美卡因滴眼液进行表面麻醉，每只眼重复测量10次，标准差＜0.04 mm，取平均值。
小鼠经5%水合氯醛麻醉后取眼球，分离视网膜，并将其修剪成四叶草形状。先将视网膜在PBS中清洗3次（10 min/次），然后置于含3% H2O2的PBS中室温振荡孵育20 min以去除内源性的过氧化物酶，最后PBS清洗3次（10 min/次）。加入封闭液（5%驴血清+1%牛血清白蛋白+0.2%赖氨酸+1 mol PBS）室温下封闭2 h后，加入用封闭液稀释的一抗（抗绿色荧光蛋白，1∶500，美国Novus Biologicals公司）4 ℃孵育2 d后加入用封闭液稀释的二抗（生物素Biotin标记亲和纯化驴抗羊IgG二抗，1∶500，美国Jackson Immuno Research公司），室温孵育2 h，PBS清洗3次（10 min/次）。然后将视网膜置入亲和素-生物素复合体（1∶500）4 ℃过夜。PBS清洗后，再经0.1 mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）清洗5 min。将视网膜置入DAB染色液中避光静置数分钟至切片显色。最后0.1 mol/L Tris-HCl清洗10 min，PBS清洗2次（10 min/次），封片。
封片后的载玻片静置晾干。在明场10倍镜下，挑选显色清晰、结构完整的RGC，先描绘视网膜的外轮廓。在63倍水镜下，使用Neurolucida分析系统在线神经元三维重构系统重构目标神经元的三维立体结构，包括胞体、树突和轴突（图1A）。利用Neurolucida Explorer分析软件对重构的RGC三维结构进行定量分析对比，包括胞体的周长及面积、树突数量、树突长度、树突表面积、树突体积、树突的水平及垂直延展距离、树突分级数、弯曲度及分支角度；同心圆分析获得树突分支点数目及分支长度等参数在内的23个形态学参数（图1B～1G）。
图1
部分形态学参数分析示意图
小鼠颈椎脱臼后取眼球，4%多聚甲醛溶液固定20 min后取视网膜并修剪成四叶草形状。视网膜经0.1 mol PBS中清洗后加入封闭液（6%驴血清+1%牛血清白蛋白+ 0.2% Triton X-100，pH=7.4）室温封闭2 h。然后加入一抗（Brn3a抗体，sc-31984，1:50，美国Santa Cruz公司），4 ℃孵育2 d，加入二抗（生物素Biotin标记亲和纯化驴抗羊IgG二抗，1:400，美国Jackson immuno Research公司）孵育2 h。PBS清洗3次（10 min/次），封片。利用共聚焦显微镜（Imager-Z1，德国Zeiss公司）在视网膜四叶草的近端和远端两个视野拍照，共取8个视野进行分析。计数DAPI标记的所有RCG层细胞和Brn3a抗体标记的RGC。
1.3 统计学方法
采用SPSS19.0软件进行统计分析，数据用均数±标准差（
）表示。形觉剥夺组剥夺眼及其对侧眼、对照眼之间各参数比较采用单因素方差分析，并用最小显著差法校正。组内左右眼之间各参数比较采用配对 t 检验。不同类型RGC占所有重构RGC的比例比较采用 χ2 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 形觉剥夺对屈光度、眼轴相关参数及RGC数量的影响
形觉剥夺前，形觉剥夺组剥夺眼、对侧眼以及对照眼屈光度（F=0.849，P=0.436）和前房深度（F=0.197，P=0.822）、玻璃体腔深度（F=0.470，P=0.629）、眼轴长度（F=0.024，P=0.102）等眼轴相关参数比较，差异无统计学意义。形觉剥夺后2周，形觉剥夺组剥夺眼较对照眼出现了显著的近视改变（F=15.009，P＜0.001），同时伴有玻璃体腔深度加深（F=3.360，P=0.047）、眼轴延长（F=5.011，P=0.013）；但前房深度和晶状体厚度无明显变化（P＞0.05）（表1，图2）。
表1
形觉剥夺后2周剥夺眼、对侧眼及对照眼屈光度、眼轴相关参数比较（
）
图2
形觉剥夺后2周形觉剥夺组剥夺眼、对侧眼及对照眼屈光度、眼轴相关参数比较。2A示屈光度；2B示玻璃体腔深度；2C示眼轴长度。*P＜0.05，**P＜0.001
形觉剥夺组剥夺眼（n=4）、对侧眼（n=3）以及对照眼（n=4）视网膜后极部RGC数量分别为（324±23）、（279±15）、（377±23）个，视网膜周边部RGC数量分别为（270±31）、（288±8）、（310±47）个。在视网膜后极部，形觉剥夺组剥夺眼RGC数量较对侧眼及对照组明显减少，差异有统计学意义（F=4.769，P=0.035）；但在周边区，差异无统计学意义（F=1.517，P=0.266）。
2.2 RGC的类型及形态
根据树突野形态，三维重构的RGC可分为Type 1、Type 2、Type 3、Type 4共4种类型（图3）。4种类型的RGC占比无明显差异（χ2=6.853，P=0.335，各类型调整残差≤2）（图4）。
图3
不同类型RGC形态示意图。3A示Type 1；3B示Type 2；3C示Type 3；3D示Type 4
图4
不同类型RGC在视网膜上的分布及其占各组重构细胞的比例。4A示4种类型RGC在视网膜上的分布示意图，蓝色代表Type 1，白色代表Type 2，红色代表Type 3，绿色代表Type 4；4B示4种类型RGC占各组重构细胞的比例
Type 1 RGC具有小而紧凑的树突野；树突支较少且短；树突支分支级数、树突节段多但短。与Type 1 RGC比较，Type 2 RGC树突野更大；树突分布较稀疏；树突支数量更多且更长；树突支分支级数、树突节段数较少，但长度更长。与Type 2 RGC比较，Type 3 RGC树突野更大，形态相似；树突分布更丰富；树突支数量更多且更长；树突支分支级数、树突节段数较少，但长度更长。Type 4 RGC树突野形态是4种类型RGC中最大的；树突分布最为稀疏；树突支数量与Type 2、3 RGC相仿，长度略长；树突支分支级数与Type 3 RGC接近；树突节段数量与Type 2、3 RGC接近，但长度更长（表2，图5）。
表2
形觉剥夺前4种类型RGC树突野、树突支、树突分支以及树突节段参数比较（
）
图5
4种类型RGC树突野、树突支、树突分支以及树突节段等参数比较。5A示树突野参数；5B示树突支参数；5C示树突分支参数；5D示树突节段参数。*P＜0.05
同心圆分析结果显示，Type 1、Type 2、Type 3、Type 4 RGC树突分支最多的区域分别集中在距离胞体50、90、100、130 μm处，分别在距离胞体140、200、210、240 μm处基本不再发出新的分支（图6）。Type 3 RGC树突分支最多的区域与Type 2 RGC接近，但在距离胞体110 μm以内树突分支数量和长度较Type 2 RGC明显少和短，在110 μm以外则树突分支数量和长度均较Type 2 RGC更多。
图6
4种类型RGC同心圆分析图。6A示离胞体不同距离内树突分支点的数量；6B示离胞体不同距离内树突分支长度。*P＜0.05
2.3 形觉剥夺对4种类型RGC形态的影响
形觉剥夺对Type 1 RGC树突野大小影响不大，但明显增加了树突野最大水平延展，降低了树突弯曲度。与对侧眼及对照眼比较，剥夺眼Type 1 RGC树突野最大水平延展明显增加（F=4.312，P=0.019），树突弯曲度明显下降（F=6.608，P=0.003），差异均有统计学意义（图7）。同心圆分析结果显示，形觉剥夺明显增加了Type 1 RGC距离胞体50～90 μm区域内的树突分支点数量，增长了树突分支长度（图8）。
图7
剥夺眼、对侧眼及对照眼Type 1 RGC树突野面积及树突弯曲度参数比较。7A示树突野面积参数；7B示树突弯曲度参数。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
图8
剥夺眼、对侧眼及对照眼Type 1 RGC树突分布同心圆分析图。8A示剥夺眼Type 1 RGC距离胞体50~90 μm区域内的树突分支点数量增多；8B示剥夺眼Type 1 RGC距离胞体50~90 μm区域内树突分支长度增长。*P＜0.05
和Type1 RGC接近，形觉剥夺对Type 2 RGC的树突野面积（F=1.780，P=0.180）以及最大水平延展（F=2.722，P=0.077）没有明显影响，但增加了其最大垂直延展（F=4.704，P=0.014）。同时，形觉剥夺减小了树突分支角（F=5.180，P=0.009）以及树突样条曲线角度数（F=5.672，P=0.006）。剥夺眼Type 2 RGC树突野最大垂直延展较对侧眼明显增加（P=0.012），但与对照眼无明显差异（P=0.728）。剥夺眼Type 2 RGC树突弯曲度和对侧眼及对照眼相比均无明显改变（F=2.606，P=0.085）；但树突分支角（P=0.046）、树突样条曲线角（P=0.026）较对侧眼明显变小（图9）。同心圆分析结果显示，形觉剥夺明显缩短了20～30 μm及60～70 μm区域内Type 2 RGC树突分支长度；增加了120～180 μm区域内Type 2 RGC树突分支点数量以及150～180 μm区域内树突分支长度（图10）。
图9
剥夺眼、对侧眼及对照眼Type 2 RGC树突野面积及树突弯曲度参数比较。9A示树突野面积参数；9B示树突弯曲度参数。*P＜0.05，**P＜0.01
图10
剥夺眼、对侧眼及对照眼Type 2 RGC树突分布同心圆分析图。10A示剥夺眼Type 2 RGC距离胞体120~180 μm区域内的树突分支点数量增多；10B示剥夺眼Type 2 RGC距离胞体150~180 μm区域内树突分支长度增长，但在20~30 μm、60~70 μm区域内树突分支长度较对侧眼缩短。*P＜0.05
剥夺眼与对侧眼Type 3 RGC之间的所有形态参数均无差异（P＞0.05）。剥夺眼Type 3 RGC树突野最大垂直延展较对照眼明显下降（P=0.035）（图11）。同心圆分析结果显示，形觉剥夺明显增加了130～240 μm区域内Type 3 RGC树突分支树突分支点数量，增长了树突分支长度（图12）。
图11
剥夺眼、对侧眼及对照眼Type 3 RGC树突野面积参数比较。*P＜0.05
图12
剥夺眼、对侧眼及对照眼Type 3 RGC树突分布同心圆分析图。12A示剥夺眼Type 3 RGC距离胞体130~240 μm区域内的树突分支点数量增多；12B示剥夺眼Type 3 RGC距离胞体120 μm处及150~230 μm区域内树突分支长度增长。*P＜0.05
剥夺眼Type 4 RGC树突野最大水平（F=2.476，P=0.101）、垂直延展（F=4.287，P=0.023）明显增加，树突节段长度变长（F=7.482，P=0.002），表面积增大（F=14.814，P=0.000），容积变大（F=11.900，P＜0.001），但是树突节段数量变少（F=7.067，P=0.003）（图13）。同心圆分析结果显示，形觉剥夺明显减少了双眼120～150 μm区域内以及180 μm处Type 4 RGC树突分支树突分支点数量，但对树突分支长度没有影响（图14）。
图13
剥夺眼、对侧眼及对照眼Type 4 RGC树突野面积及树突节段参数比较。13A示树突野面积参数；13B示树突节段参数。*P＜0.05，**P＜0.01
图14
剥夺眼、对侧眼及对照眼Type 4 RGC树突分布同心圆分析图。14A示形觉剥夺明显减少了双眼RGC在120~150 μm区域内以及180 μm处Type 4 RGC树突分支树突分支点数量；14B示形觉剥夺对不同同心圆范围内树突分支长度没有影响。*P＜0.05
3 讨论
本研究采用转基因荧光小鼠重构了大量RGC，通过形态学分析软件并借鉴以往对RGC形态和功能研究文献将所获得细胞进行分类。结果显示，与对侧眼与对照眼比较，剥夺眼屈光力向近视方向偏移，RGC数量明显减少。这说明形觉剥夺对RGC的形态发育有重要影响。除此之外，我们还发现形觉剥夺对4种类型RGC的形态影响各不相同。
Brn3家族是具有POU结构域的转录因子，包括Brn3a、Brn3b、Brn3c[9-10]。在视网膜上，Brn3家族只在RGC中有表达，且在完成有丝分裂后，有80%的RGC表达Brn3a。因此我们采用了Brn3a抗体来标记RGC，并进行定量分析。有研究发现，随着兔子单眼形觉剥夺时间的延长，RGC数量也随之下降[7]。本研究结果与之一致，在视网膜中心区，剥夺眼RGC数量出现明显减少的现象。研究发现，阻断ON型双极细胞的输出可以引起ON型RGC减少，提示RGC的生存与其输入有关[11]。据此我们推测，剥夺眼RGC的数量减少可能与形觉剥夺导致视觉输入减少有关。此外，视网膜中很多神经递质的释放与视觉刺激有关。有学者从出生后23～26 d每日给予小鼠视动刺激，发现其增加了RGC层内脑源性神经生长因子（BDNF）的含量，同时也增加了视网膜多巴胺水平[12]。大部分RGC表达BDNF受体TrkB[13]。已有研究发现，BDNF在缺氧损伤、视神经离断、高糖时可以对RGC提供神经保护[14-17]；在急性眼压升高时通过TrKB通路对RGC提供抗凋亡作用[18]。和BDNF相似，多巴胺也具有神经保护作用，在发育的视网膜中，多巴胺也具有抗凋亡作用[19]。形觉剥夺在多种物种中可引起视网膜多巴胺水平的下调。多巴胺可以减少大鼠发育视网膜氯胺酮、乙醇诱导的神经元凋亡[20]。因此，我们分析认为，形觉剥夺后RGC数量减少可能与视网膜BDNF和多巴胺水平下降有关。
RGC根据形态、电生理以及基因表达可以分成超过30多种亚型[21-23]。由于本研究仅能从形态入手，缺乏对其电生理以及基因表达的分析，因此难以将RGC明确为某一具体亚型，进而分析其功能。但是通过形态可以进行比较简单的分类和分析，并与功能较明确的一些亚型进行比较。本研究将200多个重构的RGC分为4种类型。其中Type 1占比最大。它的树突野较小，树突支数量少，但是树突的分支级数最高。这类细胞的树突节段数量是4类细胞中最多的，但树突节段短而细。其树突形态较平直，弯曲度是4类细胞中最小的。形觉剥夺对这类神经元的树突野大小有轻微增大作用，表现为树突野的水平延展增大。形觉剥夺后Type 1 RGC树突弯曲度减少，树突变得更加平直。这类小树突野RGC在距离胞体60～100 μm处树突分布增大。树突是神经元接受输入的结构，树突结构形态和数量的变化提示Type 1 RGC的功能在形觉剥夺的过程发生了改变。Type 1 RGC的形态接近文献中报道的一些具有小感受野的神经元，如高分辨神经节细胞和局部边缘探测细胞[24]。两者对运动视觉刺激的敏感度不同，但均表现出对小视觉刺激物的高敏感度。因此，形觉剥夺过程中，接受小视觉刺激信号的神经通路缺乏刺激，可能在近视的发生发展中发挥了一定的作用。
Type 2、3 RGC树突野形态上具有一定的相似性。这两类神经元在形态上与方向选择性RGC（DSGC）以及α-RGC比较接近。α-RGC的树突野大小是除ipRGC外最大的，因此Type 3 RGC中可能主要为α-RGC，而Type 2 中DSGC所占的比例可能会更多。形觉剥夺对Type 2、3 RGC的形态影响有所不同，对Type 2的影响主要体现在减少了其在近胞体区域的树突分布，在20～70 μm区域内树突分支长度缩短，但在远胞体段树突分支数量和长度均有所增加。这提示在形觉剥夺过程中，视觉输入的减少导致了含有DSGC和α-RGC在内的RGC树突的重分布。虽然我们的形态学数据不能精确到对真正反映突触数量的树突棘的计数，但是树突分支和长度的重分布依然提示了在形觉剥夺过程中传递到这类RGC信号的改变可能是具有异质性的，对近胞体段的输入改变不同于远胞体段树突的输入改变。形觉剥夺对Type 3 RGC的影响较Type 1、2更为显著。Type 3 RGC树突野显著增加，同时也增加了其远胞体段树突分支的数量和长度。以α-RGC为主的Type 3 RGC树突野的变大会降低视网膜分辨率，树突分布的改变也提示其输入在远胞体段出现了变化。
Type 4 RGC树突分支数目少，覆盖范围大，结构稀疏，与ipRGC形态接近[25-26]。ipRGC主要参与对非形觉的视觉刺激的影响，包括瞳孔反射、昼夜节律等功能。Type 4 RGC树突水平延展和垂直延展都有所增加。剥夺眼和对侧眼的树突分支点数量以及长度在70～170 μm区域内均明显减少。变化的趋势和前三类参与形觉视觉的RGC有所不同，而且是双眼对称性的改变。这提示形觉和非形觉RGC的功能在近视的发生发展中可能发挥了不同的作用。
综上所述，形觉剥夺过程中，视网膜的视觉刺激大幅度缺失，这些缺失的视觉信号包括物体的亮度、颜色、形状、运动以及非形觉信号等等。视觉刺激的缺失导致RGC减少。本研究发现不同类型的RGC在形觉剥夺后出现的改变很不一致。其中参与形觉信息传递的Type 1～3 RGC的变化比较一致，主要表现为神经节距离胞体一定距离的树突分布变丰富，树突野范围表现出变大的趋势；而参与非形觉信息传递的Type 4 RGC则表现出双眼对称性改变，树突分支变稀疏。这提示形觉和非形觉信息在屈光发育中可能具有完全不同的作用，非形觉信息可能具有双眼效应。
屈光发育关键期，合适的视觉输入是正视化的关键因子[1-2]。RGC是视网膜上将视觉信号传递到中枢的唯一神经元。不同的视觉信号特征由不同的视网膜神经通路及相应的RGC来承担[3-5]。视觉信号可分为形觉信号和非形觉信号。形觉信号包括物体的形状、运动等特征，由传统的RGC传递；非形觉信号参与昼夜节律和瞳孔对光反射等视网膜功能，主要由感光RGC（ipRGC）进行传递[3-5]。形觉和非形觉视觉信号在近视的发生发展中均发挥了重要的作用。既往研究发现，超过一半的OFF瞬时性RGC和ON持续性RGC对远视性和近视性离焦的反应有所不同[6]；兔子形觉剥夺过程中RGC的数量减少[7]。这些研究结果证实，RGC功能和数量在近视发生的过程中发挥了作用。RGC的形态是其功能的基础。比如，局部边缘探测RGC的树突野小，分支密集；而ipRGC树突野大，分支疏松[8]。因此，RGC改变可以反应哪些RGC受形觉剥夺的影响而参与近视过程，以及不同类型的RGC及其所代表的通路是否在近视过程中发挥了不同作用值得深入研究。本研究观察分析了黄色荧光蛋白（YFP）转基因小鼠形觉剥夺对不同类型RGC形态的影响，以期为进一步明确近视的视网膜机制提供理论基础。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 实验动物及其基因型鉴定、实验设计
本实验所涉及动物饲养与处理均经温州医科大学动物伦理委员会审批通过，并遵循美国视觉与眼科学研究学会关于眼科和视觉研究中对动物的处理原则。60只B6.Cg-Tg（Thy1-YFP）HJrs/J转基因小鼠（YFP转基因小鼠）购自美国杰克逊实验室，繁殖于温州医科大学动物实验室（动物伦理批号WYDW2016-0348）。该小鼠特异性标记10%～30%的RGC。所有小鼠来自YFP转基因小鼠同窝仔，均在12 h光照/12 h黑暗的照明条件下饲养于标准透光鼠笼中，光照时间为8:00至20:00，环境温度（22±2）℃。可自由摄食、进水。每3天更换清洁笼具及垫料以保持饲养环境卫生。
剪取小鼠尾巴提取DNA，经PCR后电泳。YFP转基因小鼠由C57BL/6J为背景，利用转基因细菌人工染色体技术获得。在表达胸腺细胞抗原1（Thy1）的基因片段上加上表达YFP的基因片段，杂合子小鼠体内所有表达Thy1的细胞均表达YFP。YFP阳性小鼠Thy1基因片段长度为415 bp，YFP阴性小鼠Thy1基因片段长度为324 bp。
将60只小鼠随机分为形觉剥夺组及对照组，分别为28、32只。形觉剥夺组小鼠右眼通过遮盖片进行单眼遮盖2周作为剥夺眼，同时纳入对侧眼进行分析。对照组小鼠不作任何处理，取右眼作为对照眼。形觉剥夺前及形觉剥夺后2周，测量两组小鼠屈光度及眼轴相关参数；采用免疫组织化学染色对视网膜上表达YFP的RGC进行三维重构和形态分析；采用免疫荧光染色对RGC数量进行统计。
1.2 实验方法
采用自行搭建的红外偏心摄影验光仪检测两组小鼠的屈光度，每只眼连续测量3次，取平均值。采用Cinescan A/B超声诊断仪（法国Quantel Medical公司）中的A超探头进行测量，检测参数包括前房深度、晶状体厚度、玻璃体腔深度和眼轴长度。测量前2～3 min用0.5%盐酸丙美卡因滴眼液进行表面麻醉，每只眼重复测量10次，标准差＜0.04 mm，取平均值。
小鼠经5%水合氯醛麻醉后取眼球，分离视网膜，并将其修剪成四叶草形状。先将视网膜在PBS中清洗3次（10 min/次），然后置于含3% H2O2的PBS中室温振荡孵育20 min以去除内源性的过氧化物酶，最后PBS清洗3次（10 min/次）。加入封闭液（5%驴血清+1%牛血清白蛋白+0.2%赖氨酸+1 mol PBS）室温下封闭2 h后，加入用封闭液稀释的一抗（抗绿色荧光蛋白，1∶500，美国Novus Biologicals公司）4 ℃孵育2 d后加入用封闭液稀释的二抗（生物素Biotin标记亲和纯化驴抗羊IgG二抗，1∶500，美国Jackson Immuno Research公司），室温孵育2 h，PBS清洗3次（10 min/次）。然后将视网膜置入亲和素-生物素复合体（1∶500）4 ℃过夜。PBS清洗后，再经0.1 mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）清洗5 min。将视网膜置入DAB染色液中避光静置数分钟至切片显色。最后0.1 mol/L Tris-HCl清洗10 min，PBS清洗2次（10 min/次），封片。
封片后的载玻片静置晾干。在明场10倍镜下，挑选显色清晰、结构完整的RGC，先描绘视网膜的外轮廓。在63倍水镜下，使用Neurolucida分析系统在线神经元三维重构系统重构目标神经元的三维立体结构，包括胞体、树突和轴突（图1A）。利用Neurolucida Explorer分析软件对重构的RGC三维结构进行定量分析对比，包括胞体的周长及面积、树突数量、树突长度、树突表面积、树突体积、树突的水平及垂直延展距离、树突分级数、弯曲度及分支角度；同心圆分析获得树突分支点数目及分支长度等参数在内的23个形态学参数（图1B～1G）。
图1
部分形态学参数分析示意图
小鼠颈椎脱臼后取眼球，4%多聚甲醛溶液固定20 min后取视网膜并修剪成四叶草形状。视网膜经0.1 mol PBS中清洗后加入封闭液（6%驴血清+1%牛血清白蛋白+ 0.2% Triton X-100，pH=7.4）室温封闭2 h。然后加入一抗（Brn3a抗体，sc-31984，1:50，美国Santa Cruz公司），4 ℃孵育2 d，加入二抗（生物素Biotin标记亲和纯化驴抗羊IgG二抗，1:400，美国Jackson immuno Research公司）孵育2 h。PBS清洗3次（10 min/次），封片。利用共聚焦显微镜（Imager-Z1，德国Zeiss公司）在视网膜四叶草的近端和远端两个视野拍照，共取8个视野进行分析。计数DAPI标记的所有RCG层细胞和Brn3a抗体标记的RGC。
1.3 统计学方法
采用SPSS19.0软件进行统计分析，数据用均数±标准差（）表示。形觉剥夺组剥夺眼及其对侧眼、对照眼之间各参数比较采用单因素方差分析，并用最小显著差法校正。组内左右眼之间各参数比较采用配对 t 检验。不同类型RGC占所有重构RGC的比例比较采用 χ2 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 形觉剥夺对屈光度、眼轴相关参数及RGC数量的影响
形觉剥夺前，形觉剥夺组剥夺眼、对侧眼以及对照眼屈光度（F=0.849，P=0.436）和前房深度（F=0.197，P=0.822）、玻璃体腔深度（F=0.470，P=0.629）、眼轴长度（F=0.024，P=0.102）等眼轴相关参数比较，差异无统计学意义。形觉剥夺后2周，形觉剥夺组剥夺眼较对照眼出现了显著的近视改变（F=15.009，P＜0.001），同时伴有玻璃体腔深度加深（F=3.360，P=0.047）、眼轴延长（F=5.011，P=0.013）；但前房深度和晶状体厚度无明显变化（P＞0.05）（表1，图2）。
表1
形觉剥夺后2周剥夺眼、对侧眼及对照眼屈光度、眼轴相关参数比较（）
图2
形觉剥夺后2周形觉剥夺组剥夺眼、对侧眼及对照眼屈光度、眼轴相关参数比较。2A示屈光度；2B示玻璃体腔深度；2C示眼轴长度。*P＜0.05，**P＜0.001
形觉剥夺组剥夺眼（n=4）、对侧眼（n=3）以及对照眼（n=4）视网膜后极部RGC数量分别为（324±23）、（279±15）、（377±23）个，视网膜周边部RGC数量分别为（270±31）、（288±8）、（310±47）个。在视网膜后极部，形觉剥夺组剥夺眼RGC数量较对侧眼及对照组明显减少，差异有统计学意义（F=4.769，P=0.035）；但在周边区，差异无统计学意义（F=1.517，P=0.266）。
2.2 RGC的类型及形态
根据树突野形态，三维重构的RGC可分为Type 1、Type 2、Type 3、Type 4共4种类型（图3）。4种类型的RGC占比无明显差异（χ2=6.853，P=0.335，各类型调整残差≤2）（图4）。
图3
不同类型RGC形态示意图。3A示Type 1；3B示Type 2；3C示Type 3；3D示Type 4
图4
不同类型RGC在视网膜上的分布及其占各组重构细胞的比例。4A示4种类型RGC在视网膜上的分布示意图，蓝色代表Type 1，白色代表Type 2，红色代表Type 3，绿色代表Type 4；4B示4种类型RGC占各组重构细胞的比例
Type 1 RGC具有小而紧凑的树突野；树突支较少且短；树突支分支级数、树突节段多但短。与Type 1 RGC比较，Type 2 RGC树突野更大；树突分布较稀疏；树突支数量更多且更长；树突支分支级数、树突节段数较少，但长度更长。与Type 2 RGC比较，Type 3 RGC树突野更大，形态相似；树突分布更丰富；树突支数量更多且更长；树突支分支级数、树突节段数较少，但长度更长。Type 4 RGC树突野形态是4种类型RGC中最大的；树突分布最为稀疏；树突支数量与Type 2、3 RGC相仿，长度略长；树突支分支级数与Type 3 RGC接近；树突节段数量与Type 2、3 RGC接近，但长度更长（表2，图5）。
表2
形觉剥夺前4种类型RGC树突野、树突支、树突分支以及树突节段参数比较（）
图5
4种类型RGC树突野、树突支、树突分支以及树突节段等参数比较。5A示树突野参数；5B示树突支参数；5C示树突分支参数；5D示树突节段参数。*P＜0.05
同心圆分析结果显示，Type 1、Type 2、Type 3、Type 4 RGC树突分支最多的区域分别集中在距离胞体50、90、100、130 μm处，分别在距离胞体140、200、210、240 μm处基本不再发出新的分支（图6）。Type 3 RGC树突分支最多的区域与Type 2 RGC接近，但在距离胞体110 μm以内树突分支数量和长度较Type 2 RGC明显少和短，在110 μm以外则树突分支数量和长度均较Type 2 RGC更多。
图6
4种类型RGC同心圆分析图。6A示离胞体不同距离内树突分支点的数量；6B示离胞体不同距离内树突分支长度。*P＜0.05
2.3 形觉剥夺对4种类型RGC形态的影响
形觉剥夺对Type 1 RGC树突野大小影响不大，但明显增加了树突野最大水平延展，降低了树突弯曲度。与对侧眼及对照眼比较，剥夺眼Type 1 RGC树突野最大水平延展明显增加（F=4.312，P=0.019），树突弯曲度明显下降（F=6.608，P=0.003），差异均有统计学意义（图7）。同心圆分析结果显示，形觉剥夺明显增加了Type 1 RGC距离胞体50～90 μm区域内的树突分支点数量，增长了树突分支长度（图8）。
图7
剥夺眼、对侧眼及对照眼Type 1 RGC树突野面积及树突弯曲度参数比较。7A示树突野面积参数；7B示树突弯曲度参数。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
图8
剥夺眼、对侧眼及对照眼Type 1 RGC树突分布同心圆分析图。8A示剥夺眼Type 1 RGC距离胞体50~90 μm区域内的树突分支点数量增多；8B示剥夺眼Type 1 RGC距离胞体50~90 μm区域内树突分支长度增长。*P＜0.05
和Type1 RGC接近，形觉剥夺对Type 2 RGC的树突野面积（F=1.780，P=0.180）以及最大水平延展（F=2.722，P=0.077）没有明显影响，但增加了其最大垂直延展（F=4.704，P=0.014）。同时，形觉剥夺减小了树突分支角（F=5.180，P=0.009）以及树突样条曲线角度数（F=5.672，P=0.006）。剥夺眼Type 2 RGC树突野最大垂直延展较对侧眼明显增加（P=0.012），但与对照眼无明显差异（P=0.728）。剥夺眼Type 2 RGC树突弯曲度和对侧眼及对照眼相比均无明显改变（F=2.606，P=0.085）；但树突分支角（P=0.046）、树突样条曲线角（P=0.026）较对侧眼明显变小（图9）。同心圆分析结果显示，形觉剥夺明显缩短了20～30 μm及60～70 μm区域内Type 2 RGC树突分支长度；增加了120～180 μm区域内Type 2 RGC树突分支点数量以及150～180 μm区域内树突分支长度（图10）。
图9
剥夺眼、对侧眼及对照眼Type 2 RGC树突野面积及树突弯曲度参数比较。9A示树突野面积参数；9B示树突弯曲度参数。*P＜0.05，**P＜0.01
图10
剥夺眼、对侧眼及对照眼Type 2 RGC树突分布同心圆分析图。10A示剥夺眼Type 2 RGC距离胞体120~180 μm区域内的树突分支点数量增多；10B示剥夺眼Type 2 RGC距离胞体150~180 μm区域内树突分支长度增长，但在20~30 μm、60~70 μm区域内树突分支长度较对侧眼缩短。*P＜0.05
剥夺眼与对侧眼Type 3 RGC之间的所有形态参数均无差异（P＞0.05）。剥夺眼Type 3 RGC树突野最大垂直延展较对照眼明显下降（P=0.035）（图11）。同心圆分析结果显示，形觉剥夺明显增加了130～240 μm区域内Type 3 RGC树突分支树突分支点数量，增长了树突分支长度（图12）。
图11
剥夺眼、对侧眼及对照眼Type 3 RGC树突野面积参数比较。*P＜0.05
图12
剥夺眼、对侧眼及对照眼Type 3 RGC树突分布同心圆分析图。12A示剥夺眼Type 3 RGC距离胞体130~240 μm区域内的树突分支点数量增多；12B示剥夺眼Type 3 RGC距离胞体120 μm处及150~230 μm区域内树突分支长度增长。*P＜0.05
剥夺眼Type 4 RGC树突野最大水平（F=2.476，P=0.101）、垂直延展（F=4.287，P=0.023）明显增加，树突节段长度变长（F=7.482，P=0.002），表面积增大（F=14.814，P=0.000），容积变大（F=11.900，P＜0.001），但是树突节段数量变少（F=7.067，P=0.003）（图13）。同心圆分析结果显示，形觉剥夺明显减少了双眼120～150 μm区域内以及180 μm处Type 4 RGC树突分支树突分支点数量，但对树突分支长度没有影响（图14）。
图13
剥夺眼、对侧眼及对照眼Type 4 RGC树突野面积及树突节段参数比较。13A示树突野面积参数；13B示树突节段参数。*P＜0.05，**P＜0.01
图14
剥夺眼、对侧眼及对照眼Type 4 RGC树突分布同心圆分析图。14A示形觉剥夺明显减少了双眼RGC在120~150 μm区域内以及180 μm处Type 4 RGC树突分支树突分支点数量；14B示形觉剥夺对不同同心圆范围内树突分支长度没有影响。*P＜0.05
3 讨论
本研究采用转基因荧光小鼠重构了大量RGC，通过形态学分析软件并借鉴以往对RGC形态和功能研究文献将所获得细胞进行分类。结果显示，与对侧眼与对照眼比较，剥夺眼屈光力向近视方向偏移，RGC数量明显减少。这说明形觉剥夺对RGC的形态发育有重要影响。除此之外，我们还发现形觉剥夺对4种类型RGC的形态影响各不相同。
Brn3家族是具有POU结构域的转录因子，包括Brn3a、Brn3b、Brn3c[9-10]。在视网膜上，Brn3家族只在RGC中有表达，且在完成有丝分裂后，有80%的RGC表达Brn3a。因此我们采用了Brn3a抗体来标记RGC，并进行定量分析。有研究发现，随着兔子单眼形觉剥夺时间的延长，RGC数量也随之下降[7]。本研究结果与之一致，在视网膜中心区，剥夺眼RGC数量出现明显减少的现象。研究发现，阻断ON型双极细胞的输出可以引起ON型RGC减少，提示RGC的生存与其输入有关[11]。据此我们推测，剥夺眼RGC的数量减少可能与形觉剥夺导致视觉输入减少有关。此外，视网膜中很多神经递质的释放与视觉刺激有关。有学者从出生后23～26 d每日给予小鼠视动刺激，发现其增加了RGC层内脑源性神经生长因子（BDNF）的含量，同时也增加了视网膜多巴胺水平[12]。大部分RGC表达BDNF受体TrkB[13]。已有研究发现，BDNF在缺氧损伤、视神经离断、高糖时可以对RGC提供神经保护[14-17]；在急性眼压升高时通过TrKB通路对RGC提供抗凋亡作用[18]。和BDNF相似，多巴胺也具有神经保护作用，在发育的视网膜中，多巴胺也具有抗凋亡作用[19]。形觉剥夺在多种物种中可引起视网膜多巴胺水平的下调。多巴胺可以减少大鼠发育视网膜氯胺酮、乙醇诱导的神经元凋亡[20]。因此，我们分析认为，形觉剥夺后RGC数量减少可能与视网膜BDNF和多巴胺水平下降有关。
RGC根据形态、电生理以及基因表达可以分成超过30多种亚型[21-23]。由于本研究仅能从形态入手，缺乏对其电生理以及基因表达的分析，因此难以将RGC明确为某一具体亚型，进而分析其功能。但是通过形态可以进行比较简单的分类和分析，并与功能较明确的一些亚型进行比较。本研究将200多个重构的RGC分为4种类型。其中Type 1占比最大。它的树突野较小，树突支数量少，但是树突的分支级数最高。这类细胞的树突节段数量是4类细胞中最多的，但树突节段短而细。其树突形态较平直，弯曲度是4类细胞中最小的。形觉剥夺对这类神经元的树突野大小有轻微增大作用，表现为树突野的水平延展增大。形觉剥夺后Type 1 RGC树突弯曲度减少，树突变得更加平直。这类小树突野RGC在距离胞体60～100 μm处树突分布增大。树突是神经元接受输入的结构，树突结构形态和数量的变化提示Type 1 RGC的功能在形觉剥夺的过程发生了改变。Type 1 RGC的形态接近文献中报道的一些具有小感受野的神经元，如高分辨神经节细胞和局部边缘探测细胞[24]。两者对运动视觉刺激的敏感度不同，但均表现出对小视觉刺激物的高敏感度。因此，形觉剥夺过程中，接受小视觉刺激信号的神经通路缺乏刺激，可能在近视的发生发展中发挥了一定的作用。
Type 2、3 RGC树突野形态上具有一定的相似性。这两类神经元在形态上与方向选择性RGC（DSGC）以及α-RGC比较接近。α-RGC的树突野大小是除ipRGC外最大的，因此Type 3 RGC中可能主要为α-RGC，而Type 2 中DSGC所占的比例可能会更多。形觉剥夺对Type 2、3 RGC的形态影响有所不同，对Type 2的影响主要体现在减少了其在近胞体区域的树突分布，在20～70 μm区域内树突分支长度缩短，但在远胞体段树突分支数量和长度均有所增加。这提示在形觉剥夺过程中，视觉输入的减少导致了含有DSGC和α-RGC在内的RGC树突的重分布。虽然我们的形态学数据不能精确到对真正反映突触数量的树突棘的计数，但是树突分支和长度的重分布依然提示了在形觉剥夺过程中传递到这类RGC信号的改变可能是具有异质性的，对近胞体段的输入改变不同于远胞体段树突的输入改变。形觉剥夺对Type 3 RGC的影响较Type 1、2更为显著。Type 3 RGC树突野显著增加，同时也增加了其远胞体段树突分支的数量和长度。以α-RGC为主的Type 3 RGC树突野的变大会降低视网膜分辨率，树突分布的改变也提示其输入在远胞体段出现了变化。
Type 4 RGC树突分支数目少，覆盖范围大，结构稀疏，与ipRGC形态接近[25-26]。ipRGC主要参与对非形觉的视觉刺激的影响，包括瞳孔反射、昼夜节律等功能。Type 4 RGC树突水平延展和垂直延展都有所增加。剥夺眼和对侧眼的树突分支点数量以及长度在70～170 μm区域内均明显减少。变化的趋势和前三类参与形觉视觉的RGC有所不同，而且是双眼对称性的改变。这提示形觉和非形觉RGC的功能在近视的发生发展中可能发挥了不同的作用。
综上所述，形觉剥夺过程中，视网膜的视觉刺激大幅度缺失，这些缺失的视觉信号包括物体的亮度、颜色、形状、运动以及非形觉信号等等。视觉刺激的缺失导致RGC减少。本研究发现不同类型的RGC在形觉剥夺后出现的改变很不一致。其中参与形觉信息传递的Type 1～3 RGC的变化比较一致，主要表现为神经节距离胞体一定距离的树突分布变丰富，树突野范围表现出变大的趋势；而参与非形觉信息传递的Type 4 RGC则表现出双眼对称性改变，树突分支变稀疏。这提示形觉和非形觉信息在屈光发育中可能具有完全不同的作用，非形觉信息可能具有双眼效应。
