• 珠海市人民医院心内科(广东珠海 519000);
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目的 构建人血管内皮生长因子(VEGF)mRNA 靶向小片段干扰 RNA(siRNA)表达的慢病毒载体,并测定其对 VEGFA 基因的沉默率,选择效率最高的干扰序列。 方法 设计 3 种人 VEGFA 靶向的发夹样 siRNA(KD1、 KD2、 KD3),分别 2 条互补的寡核苷酸链,退火后连接入 pGCSIL-GFP 载体,转化扩增后得到重组载体 pGCSIL-GFP-siVEGFA,进行测序。将重组载体与慢病毒包装辅助质粒 pHelper 1.0 和 pHelper 2.0 通过Lipofectamine 2000 共同转染至细胞人胚肾细胞株(293T),产生病毒后,再转染至人脐静脉内皮细胞(HUVEC),逆转录-聚合酶链反应法检测转染细胞 VEGFA mRNA 的表达水平,比较 3 种 siRNA 序列的效率。 结果 经过酶切鉴定与测序,pGCSIL-GFP-siVEGFA 构建成功。转染至 HVUEC 后,细胞 VEGFA mRNA 表达水平均明显降低(KD1:0.614±0.043; KD2: 0.334±0.030; KD3: 0.201±0.015),其中以 KD3 为相对最有效的 siRNA 序列。 结论 成功构建了针对 VEGFA mRNA 的 siRNA 载体,并可以显著抑制内皮细胞 VEGFA mRNA 的表达。

引用本文: 姜小飞, 叶芬, 石理, 陈曦, 朱卫民, 张业明. 靶向人血管内皮生长因子A基因小片段干扰RNA慢病毒载体的构建、比较及鉴定. 华西医学, 2016, 31(1): 1-6. doi: 10.7507/1002-0179.20160001 复制

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